Применение последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) для идентификации образцов Anoectochilus setaceus Blume в Тханьхоа (Вьетнам)

 Актуальность. Термин «DNA barcode» широко используется в молекулярной таксономии. По существу, этот метод основан на использовании последовательности ДНК (около 400–800 пн) в качестве стандарта для быстрой и точной идентификации и определения видовых отношений организмов. Таким образом, ДНК-штрихкоды помогают систематикам не только классифицировать и идентифицировать виды, но и контролировать, понимать и использовать биоразнообразие. В настоящем исследовании авторы провели идентификацию образцов Anoectochilus setaceus Blume, собранных в провинции Тханьхоа, на основе анализа последовательностей ITS.

Материалы и методы. Тотальную ДНК выделяли из молодых листьев образцов A. setaceus с использованием бромида цетилтриметиламмония (CTAB-метод). Сегмент гена ITS амплифицировали методом ПЦР и секвенировали. Эту генетическую последовательность анализировали, сравнивали и использовали для построения «филогенетичеческого древа» с помощью программ BioEdit, BLAST, DNASTAR.

Результаты и выводы. Нами выделены 4 последовательности генной области ITS из 4 образцов A. setaceus, собранных в Сюань Лиен и Пу Луонг провинции Тханьхоа; изученный ITS-регион имел длину 667 нуклеотидов. Полученные данные идентифицировали образцы как один и тот же вид и показали 99-процентное сходство с последовательностью ITS A. roxburghii (Wall.) Lindl., опубликованной в базе данных GenBank (GQ328774). Исследование также демонстрирует, что использование внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) является эффективным методом для идентификации образцов A. setaceus.

1. Álvarez I., Wendel J.F. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Molecular Phylogenetics and Evolution. 2003;29(3):417-434. DOI: 10.1016/S1055-7903(03)00208-2

2. Baldwin B.G., Sanderson M.J., Porter J.M., Wojciechowski M.F., Campbell C.S., Donoghue M.J. The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny. Annals of the Missouri Botanical Garden. 1995;82(2):247-277. DOI: 10.2307/2399880

3. Chac L.D., Thinh B.B., Huong H.T.T., Kiet N.T., Huan L.Q. Quantification of quercetin, isorhamnetin and ferulic acid in dry extract of Anoectochilus setaceus Blume from Vietnam. International Journal of Botany Studies. 2019;4(5):14-18.

4. Chen J.R., Shiau Y.J. Application of internal transcribed spacers and maturase K markers for identifying Anoectochilus, Ludisia, and Ludochilus. Biologia Plantarum. 2015;59(3):485-490. DOI: 10.1007/s10535-015-0520-3

5. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemistry Bulletin. 1987;19(1):11-15.

6. Gigliano S.S. Preliminary data on the usefulness of internal transcribed spacer I (ITS1) sequence in Cannabis sativa L. identification. Journal of Forensic Science. 1999;44(3):475- 477. DOI: 10.1520/JFS14497J

7. He C.N., Wang C.L., Guo S.X., Yang J.S., Xiao P.G. A novel flavonoid glucoside from Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Journal of Integrative Plant Biology. 2006;48(3):359- 363. DOI: 10.1111/j.1744-7909.2006.00179.x

8. Hu S.J., Hu H.Y., Gao H.., Liu X., Chen S.L. DNA barcoding and rapid identification of the precious herb Herba Anoectochili. Chinese Journal of Natural Medicines. 2019;17(10):738-745. DOI: 10.1016/S1875-5364(19)30090-1

9. Kress W.J., Wurdack K.J., Zimmer E.A., Weigt L.A., Janzen D.H. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2005;102(23):8369-8374. DOI: 10.1073/pnas.0503123102

10. Li D.Z., Gao L.M., Li H.T., Wang H., Ge X.J., Liu J.Q. et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2011;108(49):19641-19646. DOI: 10.1073/pnas.1104551108

11. Li M., Cao H., But P.P.H., Shaw P.C. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes. Journal of Systematics and Evolution. 2011;49(3):271-283. DOI: 10.1111/j.1759-6831.2011.00132.x

12. Lin J.M., Lin C.C., Chiu H.F., Yang J.J., Lee S.G. Evaluation of the anti-inflammatory and liver-protective effects of Anoectochilus formosanus, Ganoderma lucidum and Gynostemma pentaphyllum in rats. The American Journal of Chinese Medicine. 1993;21(01):59-69. DOI: 10.1142/S0192415X9300008X

13. Lin C.C., Huang P.C., Lin J.M. Antioxidant and hepatoprotective effects of Anoectochilus formosanus and Gynostemma pentaphyllum. The American Journal of Chinese Medicine. 2000;28(01):87-96. DOI: 10.1142/S0192415X00000118

14. Lv T., Teng R., Shao Q., Wang H., Zhang W., Li M. et al. DNA barcodes for the identification of Anoectochilus roxburghii and its adulterants. Planta. 2015;242(5):1167-1174. DOI: 10.1007/s00425-015-2353-x

15. Stoeckle M. Taxonomy, DNA, and the bar code of life. BioScience. 2003;53(9):796-797. DOI: 10.1641/0006-3568(2003)053[0796:TDATBC]2.0.CO;2

16. Takamiya T., Wongsawad P., Tajima N., Shioda N., Lu J.F., Wen C.L. et al. Identification of Dendrobium species used for herbal medicines based on ribosomal DNA internal transcribed spacer sequence. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 2011;34(5):779-782. DOI: 10.1248/bpb.34.779

17. Techen N., Parveen I., Pan Z., Khan I.A. DNA barcoding of medicinal plant material for identification. Current Opinion in Biotechnology. 2014;25:103-110. DOI: 10.1016/j.copbio.2013.09.010

18. Tripathi A.M., Tyagi A., Kumar A., Singh A., Singh S., Chaudhary L.B. et al. The internal transcribed spacer (ITS) region and trnhH-psbA are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India. PLOS ONE. 2013;8(2):e57934. DOI: 10.1371/journal.pone.0057934

19. Vietnam Academy of Science and Technology. Vietnam Red Data Book, Part II. Plants. Hanoi: Natural Science and Technology Publish. House; 2007. [in Vietnamese]

20. Wang S.Y., Kuo Y.H., Chang H.N., Kang P.L., Tsay H.S., Lin K.F. et al. Profiling and characterization antioxidant activities in Anoectochilus formosanus Hayata. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002;50(7):1859-1865. DOI: 10.1021/jf0113575

21. Wang X., Xue J., Zhang Y., Xie H., Wang Y., Weng W. et al. DNA barcodes for the identification of Stephania (Menispermaceae) species. Molecular Biology Reports. 2020;47:2197-2203. DOI: 10.1007/s11033-020-05325-6

22. Yang J.B., Wang Y.P., Möller M., Gao L.M., Wu D. Applying plant DNA barcodes to identify species of Parnassia (Parnassiaceae). Molecular Ecology Resources. 2012;12(2):267-275. DOI: 10.1111/j.1755-0998.2011.03095.x

23. Ye S., Shao Q., Zhang A. Anoectochilus roxburghii: A review of its phytochemistry, pharmacology, and clinical applications. Journal of Ethnopharmacology. 2017;209:184-202. DOI: 10.1016/j.jep.2017.07.032