Регенерация растений овощного гороха в культуре in vitro

Актуальность. Регенерация гороха (Pisum sativum L.) через индукцию органогенеза в каллусной ткани – один из основных этапов создания трансформированных линий. В этой связи цель наших исследований заключалась в разработке протокола получения растений-регенерантов овощного гороха различных морфотипов через культуру тканей посредством инициации органогенеза.

Материалы и методы. Объектами исследования были овощные сорта гороха ‘Парус’ (к-9350) и ‘Красавчик’ (к-9449). На этапе введения в асептические условия при обработке набухших и сухих семян оценивали три стерилизующих агента. Через девять суток после посадки семян на питательную среду проростки разделяли на верхушечную почку, следующий за ней узел без листового аппарата и семядольный узел. Полученные экспланты переносили на четыре варианта питательных сред индукции каллуса. Для инициации морфогенеза тестировали три модификации сред. Сформированные побеги пересаживали на среды, содержащие ½ солей МС с добавлением 2 и 4 мг/л ИМК.

Результаты. Оптимальное соотношение всхожих семян к неинфицированным эксплантам получено при обработке сухих семян 1-процентным раствором NaOCl. Образование каллуса зафиксировано у всех типов эксплантов на всех вариантах сред. Изучение влияния гормонов роста на побегообразование каллусных агрегатов показало, что повышение концентрации цитокинина приводит к увеличению числа каллусов, образующих побеги, и количества побегов.

Заключение. Разработан протокол получения растений-регенерантов через культуру тканей посредством инициации органогенеза. Для индукции каллусной ткани питательные среды МСК2 (НУК 5 мг/л) и МСК3 (ИМК 6 мг/л и БАП 1 мг/л) рекомендованы как наиболее органогенные. Оптимальной средой для образования побегов является МСП2 (БАП 2,5 мг/л и ИМК 0,5 мг/л). Варианты сред для формирования корней имеют схожую положительную эффективность. Способность к регенерации в культуре тканей у сортов ‘Парус’ и ‘Красавчик’ была сопоставима.

1. Bhowmik P., Yan W., Hodgins C., Polley B., Warkentin T., Nickerson M. et al. CRISPR/Cas9-mediated lipoxygenase gene-editing in yellow pea leads to major changes in fatty acid and flavor profiles. Frontiers in Plant Science. 2023;14:1246905. DOI: 10.3389/fpls.2023.1246905

2. El Sayed H., El Sayed A. Regeneration of callus and organogenesis from explants in Pisum sativum L. using various basal medium cultures. Egyptian Journal of Experimental Biology. 2011;7(1):143-151. URL: https://www.egyseb.net//?mno=186938 [дата обращения: 09.03.2024].

3. Finer J.J. Generation of transgenic soybean (Glycine max) via particle bombardment of embryogenic cultures. Current Protocols in Plant Biology. 2016;1(4):592-603. DOI: 10.1002/cppb.20039

4. Gan W.C., Ling A.P.K. CRISPR/Cas9 in plant biotechnology: applications and challenges. BioTechnologia. 2022;103(1):81-93. DOI: 10.5114/bta.2022.113919

5. Hodgins C.L., Salama E.M., Kumar R., Zhao Y., Roth S.A., Cheung I.Z. et al. Creating saponin‐free yellow pea seeds by CRISPR/Cas9‐enabled mutagenesis on β‐amyrin synthase. Plant Direct. 2024;8(1):e563. DOI: 10.1002/pld3.563

6. Jackson J.A., Hobbs S.L.A. Rapid multiple shoot production from cotyledonary node explants of pea (Pisum sativum L.). In Vitro Cellular and Developmental Biology. 1990;26(8):835-838. DOI: 10.1007/bf02623626

7. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science (New York). 2012;337(6096):816-821. DOI: 10.1126/science.1225829

8. Kaur R., Donoso T., Scheske C., Lefsrud M., Singh J. Highly efficient and reproducible genetic transformation in pea for targeted trait improvement. ACS Agricultural Science and Technology. 2022;2(4):780-787. DOI: 10.1021/acsagscitech.2c00084

9. Khlestkina E.K., Shumny V.K. Prospects for application of breakthrough technologies in breeding: the CRISPR/Cas9 system for plant genome editing. Russian Journal of Genetics. 2016;52(7):676-687. DOI: 10.1134/S102279541607005X

10. Kuluev B.R., Gumerova G.R., Mikhaylova E.V., Gerashchenkov G.A., Rozhnova N.A., Vershinina Z.R. et al. Delivery of CRISPR/Cas components into higher plant cells for genome editing. Russian Journal of Plant Physiology. 2019;66(5):694-706. DOI: 10.1134/S102144371905011X

11. Kumari T., Deka S.C. Potential health benefits of garden pea seeds and pods: A review. Legume science. 2021;3(2):e82. DOI: 10.1002/leg3.82

12. Кунах В.А., Войтюк Л.И., Алхимова Л.К., Алпатова Л.К. Получение каллусных тканей и индукция органогенеза у Pisum sativum L. Физиология растений. 1984;31(3):542-548.

13. Li G., Liu R., Xu R., Varshney R.K., Ding H., Li M. et al. Development of an Agrobacterium-mediated CRISPR/Cas9 system in pea (Pisum sativum L.). The Crop Journal. 2023;11(1):132-139. DOI: 10.1016/j.cj.2022.04.011

14. Murashige T., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15(3):473-497. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

15. Nadolska-Orczyk A., Miłkowska L., Orczyk W. Two ways of plant regeneration from immature cotyledons of pea. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 1994;63(2):153-157. DOI: 10.5586/asbp.1994.020

16. Qi T., Tang T., Zhou Q., Yang W., Hassan M.J., Cheng B. et al. Optimization of protocols for the induction of callus and plant regeneration in white clover (Trifolium repens L.). International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(14):11260. DOI: 10.3390/ijms241411260

17. Сащенко М.Н., Подвигина О.А. Особенности развития растений гороха при микроклональном размножении в условиях культуры in vitro. Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2014;6(116);24-29.

18. Соболева Г.В. Регенерация растений гороха (Pisum sativum L.) в культуре каллусной ткани. Зернобобовые и крупяные культуры. 2016;3(19);27-35.

19. Song G.Q., Han X., Wiersma A.T., Zong X., Awale H.E., Kelly J.D. Induction of competent cells for Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation of common bean (Phaseolus vulgaris L.). PLoS One. 2020;15(3):e0229909. DOI: 10.1371/journal.pone.0229909

20. Türkoğlu A., Bolouri P., Haliloğlu K., Eren B., Demirel F., Işık M.İ. et al. Modeling callus induction and regeneration in hypocotyl explant of fodder pea (Pisum sativum var. arvense L.) using machine learning algorithm method. Agronomy. 2023;13(11):2835. DOI: 10.3390/agronomy13112835

21. Tzitzikas E.N., Bergervoet M., Raemakers K., Vincken J.P., van Lammeren A., Visser R.G.F. Regeneration of pea (Pisum sativum L.) by a cyclic organogenic system. Plant Cell Reports. 2004;23(7):453-460. DOI: 10.1007/s00299-004-0865-0

22. Ukhatova Y.V., Erastenkova M.V., Korshikova E.S., Krylova E. A., Mikhailova A.S., Semilet T.V. et al. Improvement of crops using the CRISPR/Cas system: new target genes. Molecular Biology. 2023;57(3):375-397. DOI: 10.1134/S0026893323030135

23. Wada N., Ueta R., Osakabe Y., Osakabe K. Precision genome editing in plants: state-of-the-art in CRISPR/Cas9-based genome engineering. BMC Plant Biology. 2020;20(1):234. DOI: 10.1186/s12870-020-02385-5

24. Wu D.T., Li W.X., Wan J.J., Hu Y.C., Gan R.Y., Zou L. A comprehensive review of pea (Pisum sativum L.): chemical composition, processing, health benefits, and food applications. Foods. 2023;12(13):2527. DOI: 10.3390/foods12132527