vir-nwТруды по прикладной ботанике, генетике и селекцииProceedings on applied botany, genetics and breeding2227-88342619-0982N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources10.30901/2227-8834-2026-2-o19vir-nw-2368Research ArticleИЗУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ РАСТЕНИЙSTUDYING AND UTILIZATION OF PLANT GENETIC RESOURCESРегенерация растений овощного гороха в культуре in vitroIn vitro regeneration of vegetable pea plantshttps://orcid.org/0000-0003-1013-7273ПутинаО. В.PutinaO. V.

Ольга Владимировна Путина, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Крымская опытно-селекционная станция – филиал ВИР

353384 Россия, Краснодарский край, Крымск, ул. Вавилова, 12

Olga V. Putina, Cand. Sci. (Biology), Senior ResearcherKrymsk Experiment Breeding Station – branch of VIR

12 Vavilova St., Krymsk 353384, Russia

olga-rhji@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1200-3113РахмангуловР. С.

Руслан Султанович Рахмангулов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией, ВИР

190000 Россия, Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42, 44

r.rakhmangulov@vir.nw.ruhttps://orcid.org/0009-0000-5789-5149ПоливараН. В.PolivaraN. V.

Надежда Васильевна Поливара, младший научный сотрудник, Крымская опытно-селекционная станция – филиал ВИР

353384 Россия, Краснодарский край, Крымск, ул. Вавилова, 12

Nadezhda V. Polivara, Associate Researcher,  Krymsk Experiment Breeding Station – branch of VIR

12 Vavilova St., Krymsk 353384, Russia

olgarhji@gamil.comhttps://orcid.org/0000-0002-5287-7635КоваленкоН. Н.KovalenkoN. N.

Наталья Николаевна Коваленко, доктор биологических наук, заведующая лабораторией, Крымская опытно-селекционная станция – филиал ВИР

353384 Россия, Краснодарский край, Крымск, ул. Вавилова, 12

Natalya N. Kovalenko, Dr. Sci. (Biology), Head of a Laboratory, Krymsk Experiment Breeding Station – branch of VIR

12 Vavilova St., Krymsk 353384, Russia

nnkovalenko59@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9366-0216УхатоваЮ. В.UkhatovaYu. V.

Юлия Васильевна Ухатова, кандидат биологических наук, заместитель директора, ВИР

190000 Россия, Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42, 44

Yulia V. Ukhatova, Cand. Sci. (Biology), Deputy Director, VIR

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia

y.ukhatova@vir.nw.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8470-8254ХлесткинаЕ. К.KhlestkinaE. K.

Елена Константиновна Хлесткина, доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, директор, ВИР

190000 Россия, Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42, 44

Elena K. Khlestkina, Dr. Sci. (Biology), Corresponding Member of the RAS, Director, VIR

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia

director@vir.nw.ruФедеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова, Крымская опытно-селекционная станция – филиал ВИРРоссияN.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources, Krymsk Experiment Breeding Station – branch of VIRRussian FederationФедеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. ВавиловаРоссияN.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic ResourcesRussian Federation202606072026187292104Copyright © Путина О.В., Рахмангулов Р.С., Поливара Н.В., Коваленко Н.Н., Ухатова Ю.В., Хлесткина Е.К., 20262026Путина О.В., Рахмангулов Р.С., Поливара Н.В., Коваленко Н.Н., Ухатова Ю.В., Хлесткина Е.К.Putina O.V., Рахмангулов Р.С., Polivara N.V., Kovalenko N.N., Ukhatova Y.V., Khlestkina E.K.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://elpub.vir.nw.ru/jour/article/view/2368Актуальность

Актуальность. Регенерация гороха (Pisum sativum L.) через индукцию органогенеза в каллусной ткани – один из основных этапов создания трансформированных линий. В этой связи цель наших исследований заключалась в разработке протокола получения растений-регенерантов овощного гороха различных морфотипов через культуру тканей посредством инициации органогенеза.

Материалы и методы

Материалы и методы. Объектами исследования были овощные сорта гороха ‘Парус’ (к-9350) и ‘Красавчик’ (к-9449). На этапе введения в асептические условия при обработке набухших и сухих семян оценивали три стерилизующих агента. Через девять суток после посадки семян на питательную среду проростки разделяли на верхушечную почку, следующий за ней узел без листового аппарата и семядольный узел. Полученные экспланты переносили на четыре варианта питательных сред индукции каллуса. Для инициации морфогенеза тестировали три модификации сред. Сформированные побеги пересаживали на среды, содержащие ½ солей МС с добавлением 2 и 4 мг/л ИМК.

Результаты

Результаты. Оптимальное соотношение всхожих семян к неинфицированным эксплантам получено при обработке сухих семян 1-процентным раствором NaOCl. Образование каллуса зафиксировано у всех типов эксплантов на всех вариантах сред. Изучение влияния гормонов роста на побегообразование каллусных агрегатов показало, что повышение концентрации цитокинина приводит к увеличению числа каллусов, образующих побеги, и количества побегов.

Заключение

Заключение. Разработан протокол получения растений-регенерантов через культуру тканей посредством инициации органогенеза. Для индукции каллусной ткани питательные среды МСК2 (НУК 5 мг/л) и МСК3 (ИМК 6 мг/л и БАП 1 мг/л) рекомендованы как наиболее органогенные. Оптимальной средой для образования побегов является МСП2 (БАП 2,5 мг/л и ИМК 0,5 мг/л). Варианты сред для формирования корней имеют схожую положительную эффективность. Способность к регенерации в культуре тканей у сортов ‘Парус’ и ‘Красавчик’ была сопоставима.

Background

Background. The objective of our research was to obtain regenerated plants of vegetable pea through tissue culture by initiating organogenesis.

Materials and methods

Materials and methods. Two vegetable pea cultivars served as the research material. Three sterilizing agents were evaluated when processing dry and swollen seeds. The explants were the apical bud, the next node without the leaf apparatus, and the cotyledon node. Four variants of callus induction media were studied, three variants for shoot formation, and two for rhizogenesis.

Results

Results. Callus formation was recorded for all types of explants on all variants of media. The study of the effect of phytohormones on the shoot formation in callus aggregates showed that an increase in the concentration of cytokinin leads to an increase in the number of shoot-forming calli and the number of shoots.

Conclusions

Conclusions. Dry seeds should be used when cultivating pea plants with wrinkled seeds in vitro, with 1% NaOCl solution as a sterilizing agent. For callus tissue production, it is recommended to use the second (NAA, 5 mg/L) or third (IBK, 6 mg/L, and 6-BAP, 1 mg/L) variants of MSC. MSS2 (6-BAP, 2.5 mg/L, and IBC, 0.5 mg/L) proved to be the optimal shoot induction environment. The media variants for rhizogenesis induction had similar effectiveness.

овощной горохстерилизация семянкаллусорганогенезvegetable peaseed sterilizationcallusorganogenesisработа выполнена при финансовой поддержке проекта РНФ № 21-66-00012 «Создание с использованием генетических технологий и изучение новых линий растений, адаптированных к меняющимся условиям окружающей среды, обладающих повышенной продуктивностью и диетической ценностью».the work was supported financially by the Russian Science Foundation under Project No. 21-66-00012 “Genetic technologies-based development and assessement of novel lines of crop plants, adapted to the changing environment and having increased productivity and dietary value”.ReferencesBhowmik P., Yan W., Hodgins C., Polley B., Warkentin T., Nickerson M. et al. CRISPR/Cas9-mediated lipoxygenase gene-editing in yellow pea leads to major changes in fatty acid and flavor profiles. Frontiers in Plant Science. 2023;14:1246905. DOI: 10.3389/fpls.2023.1246905Bhowmik P., Yan W., Hodgins C., Polley B., Warkentin T., Nickerson M. et al. CRISPR/Cas9-mediated lipoxygenase gene-editing in yellow pea leads to major changes in fatty acid and flavor profiles. Frontiers in Plant Science. 2023;14:1246905. DOI: 10.3389/fpls.2023.1246905El Sayed H., El Sayed A. Regeneration of callus and organogenesis from explants in Pisum sativum L. using various basal medium cultures. Egyptian Journal of Experimental Biology. 2011;7(1):143-151. URL: https://www.egyseb.net//?mno=186938 [дата обращения: 09.03.2024].El Sayed H., El Sayed A. Regeneration of callus and organogenesis from explants in Pisum sativum L. using various basal medium cultures. Egyptian Journal of Experimental Biology. 2011;7(1):143-151. URL: https://www.egyseb.net//?mno=186938 [дата обращения: 09.03.2024].Finer J.J. Generation of transgenic soybean (Glycine max) via particle bombardment of embryogenic cultures. Current Protocols in Plant Biology. 2016;1(4):592-603. DOI: 10.1002/cppb.20039Finer J.J. Generation of transgenic soybean (Glycine max) via particle bombardment of embryogenic cultures. Current Protocols in Plant Biology. 2016;1(4):592-603. DOI: 10.1002/cppb.20039Gan W.C., Ling A.P.K. CRISPR/Cas9 in plant biotechnology: applications and challenges. BioTechnologia. 2022;103(1):81-93. DOI: 10.5114/bta.2022.113919Gan W.C., Ling A.P.K. CRISPR/Cas9 in plant biotechnology: applications and challenges. BioTechnologia. 2022;103(1):81-93. DOI: 10.5114/bta.2022.113919Hodgins C.L., Salama E.M., Kumar R., Zhao Y., Roth S.A., Cheung I.Z. et al. Creating saponin‐free yellow pea seeds by CRISPR/Cas9‐enabled mutagenesis on β‐amyrin synthase. Plant Direct. 2024;8(1):e563. DOI: 10.1002/pld3.563Hodgins C.L., Salama E.M., Kumar R., Zhao Y., Roth S.A., Cheung I.Z. et al. Creating saponin‐free yellow pea seeds by CRISPR/Cas9‐enabled mutagenesis on β‐amyrin synthase. Plant Direct. 2024;8(1):e563. DOI: 10.1002/pld3.563Jackson J.A., Hobbs S.L.A. Rapid multiple shoot production from cotyledonary node explants of pea (Pisum sativum L.). In Vitro Cellular and Developmental Biology. 1990;26(8):835-838. DOI: 10.1007/bf02623626Jackson J.A., Hobbs S.L.A. Rapid multiple shoot production from cotyledonary node explants of pea (Pisum sativum L.). In Vitro Cellular and Developmental Biology. 1990;26(8):835-838. DOI: 10.1007/bf02623626Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science (New York). 2012;337(6096):816-821. DOI: 10.1126/science.1225829Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science (New York). 2012;337(6096):816-821. DOI: 10.1126/science.1225829Kaur R., Donoso T., Scheske C., Lefsrud M., Singh J. Highly efficient and reproducible genetic transformation in pea for targeted trait improvement. ACS Agricultural Science and Technology. 2022;2(4):780-787. DOI: 10.1021/acsagscitech.2c00084Kaur R., Donoso T., Scheske C., Lefsrud M., Singh J. Highly efficient and reproducible genetic transformation in pea for targeted trait improvement. ACS Agricultural Science and Technology. 2022;2(4):780-787. DOI: 10.1021/acsagscitech.2c00084Khlestkina E.K., Shumny V.K. Prospects for application of breakthrough technologies in breeding: the CRISPR/Cas9 system for plant genome editing. Russian Journal of Genetics. 2016;52(7):676-687. DOI: 10.1134/S102279541607005XKhlestkina E.K., Shumny V.K. Prospects for application of breakthrough technologies in breeding: the CRISPR/Cas9 system for plant genome editing. Russian Journal of Genetics. 2016;52(7):676-687. DOI: 10.1134/S102279541607005XKuluev B.R., Gumerova G.R., Mikhaylova E.V., Gerashchenkov G.A., Rozhnova N.A., Vershinina Z.R. et al. Delivery of CRISPR/Cas components into higher plant cells for genome editing. Russian Journal of Plant Physiology. 2019;66(5):694-706. DOI: 10.1134/S102144371905011XKuluev B.R., Gumerova G.R., Mikhaylova E.V., Gerashchenkov G.A., Rozhnova N.A., Vershinina Z.R. et al. Delivery of CRISPR/Cas components into higher plant cells for genome editing. Russian Journal of Plant Physiology. 2019;66(5):694-706. DOI: 10.1134/S102144371905011XKumari T., Deka S.C. Potential health benefits of garden pea seeds and pods: A review. Legume science. 2021;3(2):e82. DOI: 10.1002/leg3.82Kumari T., Deka S.C. Potential health benefits of garden pea seeds and pods: A review. Legume science. 2021;3(2):e82. DOI: 10.1002/leg3.82Кунах В.А., Войтюк Л.И., Алхимова Л.К., Алпатова Л.К. Получение каллусных тканей и индукция органогенеза у Pisum sativum L. Физиология растений. 1984;31(3):542-548.Kunakh V.A., Voiltyuk L.I., Alkhimova E.G., Alpatova L.K. Callus tissue formation and induction of organogenesis in Pisum sativum L. (Polucheniye kallusnykh tkaney i induktsiya organogeneza u Pisum sativum L.). Russian Journal of Plant Physiology. 1984;31(3):542-548.Li G., Liu R., Xu R., Varshney R.K., Ding H., Li M. et al. Development of an Agrobacterium-mediated CRISPR/Cas9 system in pea (Pisum sativum L.). The Crop Journal. 2023;11(1):132-139. DOI: 10.1016/j.cj.2022.04.011Li G., Liu R., Xu R., Varshney R.K., Ding H., Li M. et al. Development of an Agrobacterium-mediated CRISPR/Cas9 system in pea (Pisum sativum L.). The Crop Journal. 2023;11(1):132-139. DOI: 10.1016/j.cj.2022.04.011Murashige T., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15(3):473-497. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.xMurashige T., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15(3):473-497. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.xNadolska-Orczyk A., Miłkowska L., Orczyk W. Two ways of plant regeneration from immature cotyledons of pea. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 1994;63(2):153-157. DOI: 10.5586/asbp.1994.020Nadolska-Orczyk A., Miłkowska L., Orczyk W. Two ways of plant regeneration from immature cotyledons of pea. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 1994;63(2):153-157. DOI: 10.5586/asbp.1994.020Qi T., Tang T., Zhou Q., Yang W., Hassan M.J., Cheng B. et al. Optimization of protocols for the induction of callus and plant regeneration in white clover (Trifolium repens L.). International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(14):11260. DOI: 10.3390/ijms241411260Qi T., Tang T., Zhou Q., Yang W., Hassan M.J., Cheng B. et al. Optimization of protocols for the induction of callus and plant regeneration in white clover (Trifolium repens L.). International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(14):11260. DOI: 10.3390/ijms241411260Сащенко М.Н., Подвигина О.А. Особенности развития растений гороха при микроклональном размножении в условиях культуры in vitro. Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2014;6(116);24-29.Sashchenko M.N., Podvigina O.A. Peculiarities of pea plant development during microclonal propagation in vitro culture conditions. Bulletin of Altai State Agricultural University. 2014;6(116):24-29. [in Russian]Соболева Г.В. Регенерация растений гороха (Pisum sativum L.) в культуре каллусной ткани. Зернобобовые и крупяные культуры. 2016;3(19);27-35.Soboleva G.V. Regeneration of peas plants (Pisum sativum L.) in callus tissue culture. Legumes and Groat Crops. 2016;3(19);27-35. [in Russian]Song G.Q., Han X., Wiersma A.T., Zong X., Awale H.E., Kelly J.D. Induction of competent cells for Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation of common bean (Phaseolus vulgaris L.). PLoS One. 2020;15(3):e0229909. DOI: 10.1371/journal.pone.0229909Song G.Q., Han X., Wiersma A.T., Zong X., Awale H.E., Kelly J.D. Induction of competent cells for Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation of common bean (Phaseolus vulgaris L.). PLoS One. 2020;15(3):e0229909. DOI: 10.1371/journal.pone.0229909Türkoğlu A., Bolouri P., Haliloğlu K., Eren B., Demirel F., Işık M.İ. et al. Modeling callus induction and regeneration in hypocotyl explant of fodder pea (Pisum sativum var. arvense L.) using machine learning algorithm method. Agronomy. 2023;13(11):2835. DOI: 10.3390/agronomy13112835Türkoğlu A., Bolouri P., Haliloğlu K., Eren B., Demirel F., Işık M.İ. et al. Modeling callus induction and regeneration in hypocotyl explant of fodder pea (Pisum sativum var. arvense L.) using machine learning algorithm method. Agronomy. 2023;13(11):2835. DOI: 10.3390/agronomy13112835Tzitzikas E.N., Bergervoet M., Raemakers K., Vincken J.P., van Lammeren A., Visser R.G.F. Regeneration of pea (Pisum sativum L.) by a cyclic organogenic system. Plant Cell Reports. 2004;23(7):453-460. DOI: 10.1007/s00299-004-0865-0Tzitzikas E.N., Bergervoet M., Raemakers K., Vincken J.P., van Lammeren A., Visser R.G.F. Regeneration of pea (Pisum sativum L.) by a cyclic organogenic system. Plant Cell Reports. 2004;23(7):453-460. DOI: 10.1007/s00299-004-0865-0Ukhatova Y.V., Erastenkova M.V., Korshikova E.S., Krylova E. A., Mikhailova A.S., Semilet T.V. et al. Improvement of crops using the CRISPR/Cas system: new target genes. Molecular Biology. 2023;57(3):375-397. DOI: 10.1134/S0026893323030135Ukhatova Y.V., Erastenkova M.V., Korshikova E.S., Krylova E. A., Mikhailova A.S., Semilet T.V. et al. Improvement of crops using the CRISPR/Cas system: new target genes. Molecular Biology. 2023;57(3):375-397. DOI: 10.1134/S0026893323030135Wada N., Ueta R., Osakabe Y., Osakabe K. Precision genome editing in plants: state-of-the-art in CRISPR/Cas9-based genome engineering. BMC Plant Biology. 2020;20(1):234. DOI: 10.1186/s12870-020-02385-5Wada N., Ueta R., Osakabe Y., Osakabe K. Precision genome editing in plants: state-of-the-art in CRISPR/Cas9-based genome engineering. BMC Plant Biology. 2020;20(1):234. DOI: 10.1186/s12870-020-02385-5Wu D.T., Li W.X., Wan J.J., Hu Y.C., Gan R.Y., Zou L. A comprehensive review of pea (Pisum sativum L.): chemical composition, processing, health benefits, and food applications. Foods. 2023;12(13):2527. DOI: 10.3390/foods12132527Wu D.T., Li W.X., Wan J.J., Hu Y.C., Gan R.Y., Zou L. A comprehensive review of pea (Pisum sativum L.): chemical composition, processing, health benefits, and food applications. Foods. 2023;12(13):2527. DOI: 10.3390/foods12132527

The authors declare that there are no conflicts of interest present.