Разработка протоколов для введения зрелых семян риса (Oryza sativa L. subsp. indica и subsp. japonica) в асептические условия и получения каллусной культуры

Актуальность. Рис (Oryza sativa L.) считается модельным однодольным растением, что делает его одной из наиболее изученных культур. Несмотря на это, генетики, селекционеры и биотехнологи сталкиваются с трудностями, такими как ранний некроз и слабое образование каллуса у сортов и линий subsp. indica S. Kato. В то время как у сортов риса подвида japonica S. Kato отмечена высокая способность к образованию каллуса (40%), у сортов и линий подвида indica ответ на индукцию каллусообразования составил 0%.

Материалы и методы. Объектом исследования послужили 40 образцов риса из коллекции ВИР (11 образцов относятся к подвиду indica и 29 – к подвиду japonica). Проращивание семян и получение каллусной массы проводили на питательных средах Chu (N6), Gamborg B₅ и MS. Для образования каллуса отбирали зрелые семена риса, очищенные от семенной оболочки, и в дальнейшем культивировали на питательных средах разного состава. Растительный материал поддерживали на светоустановках в режиме светового дня 16/8 ч при температуре 23–24°C и освещении 25 000 люкс.

Результаты. Отработан протокол стерилизации семян для дальнейшего введения в асептические условия in vitro. Все 40 образцов проросли в асептической культуре. Получена каллусная культура у образцов риса subsp. indica (41% каллусообразования) и subsp. japonica (38% каллусообразования). Разработаны протоколы сред для поддержания, пролиферации клеток каллусной массы и получения регенерантов.

Заключение. Разработаны и модифицированы протоколы для получения каллусной культуры из двух подвидов риса. Для образцов subsp. indica выбрана питательная среда Chu (N6) с добавлением 2 мг/л 2,4D и 0,5 г/л казеина. Наиболее подходящей средой для индукции каллусообразования образцов subsp. japonica выбрана среда ½MS с добавлением 0,2 г/л пролина, 0,4 мг/л кинетина и 0,8 мг/л 2,4D. При добавлении в питательную среду MS пролина (0,5 г/л) и гидролизата казеина (0,3 г/л) удалось инициировать начальную стадию регенерации побегов и корней.

1. Ali J., Nicolas K.L.C., Akther S., Torabi A., Ebadi A.A., Marfori-Nazarea C.M. et al. Improved anther culture media for enhanced callus formation and plant regeneration in rice (Oryza sativa L.). Plants (Basel). 2021;10(5):839. DOI: 10.3390/plants10050839

2. Chu C.C. The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops. In: Proceedings of Symposium on Plant Tissue Culture, 25–30 May 1978. Peking: Science Press; 1978. p.43-50.

3. Do V.G., Kim S., Win N.M., Kwon S.I., Kweon H., Yang S. et al. Efficient regeneration of transgenic rice from embryogenic callus via Agrobacterium-mediated transformation: a case study using GFP and apple MdFT1 genes. Plants (Basel). 2024;13(19):2803. DOI: 10.3390/plants13192803

4. Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of glucanases in suspension cultures of wheat and barley. Canadian Journal of Biochemistry. 1968;46(5):417-421. DOI: 10.1139/o68-063

5. Khandagale K.S., Chavhan R., Nadaf A.B. RNAi-mediated down regulation of BADH2 gene for expression of 2-acetyl-1-pyrroline in non-scented indica rice IR-64 (Oryza sativa L.). 3 Biotech. 2020;10(4):145. DOI: 10.1007/s13205-020-2131-8

6. Кильчевский А.В., Лещина Н.Ю., Пугачева И.Г. Результаты селекции томата на холодостойкость и продуктивность с использованием гаметофитно-спорофитного отбора. Овощеводство. 2008;14:166-175.

7. Liao W., Cao L. Conservation and evolution of wildlife in the context of climate change and human population growth. Biology (Basel). 2024;13(6):440. DOI: 10.3390/biology13060440

8. Majumder S., Datta K., Datta S.K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of rice by hygromycin phosphotransferase (hptII) gene containing CRISPR/Cas9 vector. Methods in Molecular Biology. 2021;2238:69-79. DOI: 10.1007/978-1-0716-1068-8_5

9. Mayakaduwa R., Silva T. Haploid induction in indica rice: exploring new opportunities. Plants (Basel). 2023;12(17):3118. DOI: 10.3390/plants12173118

10. Miah M.A.A., Earle E.D., Khush G.S. Inheritance of callus formation ability in anther cultures of rice, Oryza sativa L. Theoretical and Applied Genetics. 1985;70(2):113-116. DOI: 10.1007/BF00275308

11. Mikami T., Kinoshita T. Genotypic effects on the callus formation from different explants of rice, Oryza sativa L. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1988;12(3):311-314. DOI: 10.1007/BF00034374

12. Murashige T., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15(3):473-497. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

13. Raval M., Chattoo B.B. Role of media constituents and proline in callus growth, somatic embryogenesis and regeneration of Oryza sativa cv Indica. Indian Journal of Experimental Biology. 1993;31(7):600-603.

14. Reinert J., Bajaj Y.P.S. (eds). Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture. Berlin; Heidelberg; New York: Springer; 1977.

15. Rojas-Vásquez R., Hernández-Soto A., Arrieta-Espinoza G., Gatica-Arias A. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in indica rice (Oryza sativa L. subsp. indica var. CR-5272). Methods in Molecular Biology. 2024;2788:257-271. DOI: 10.1007/978-1-0716-3782-1_15

16. Sakina A., Mir S., Najeeb S., Zargar S.M., Nehvi F.A., Rather Z.A. et al. Improved protocol for efficacious in vitro androgenesis and development of doubled haploids in temperate japonica rice. PLoS One. 2020;15(11):e0241292. DOI: 10.1371/journal.pone.0241292

17. Tariq M., Ali G., Hadi F., Ahmad S., Ali N., Shah A.A. Callus induction and in vitro plant regeneration of rice (Oryza sativa L.) under various conditions. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2008;11(2):255-259. DOI: 10.3923/pjbs.2008.255.259

18. Van den Berg L., Walsh C.M. Household food insecurity in South Africa from 1999 to 2021: a metrics perspective. Public Health Nutrition. 2023;26(11):2183-2199. DOI: 10.1017/S1368980023001878

19. Wani S.H., Sanghera G.S., Gosal S.S. An efficient and reproducible method for regeneration of whole plants from mature seeds of a high yielding Indica rice (Oryza sativa L.) variety PAU 201. New Biotechnology. 2011;28(4):418-422. DOI:10.1016/j.nbt.2011.02.006

20. Young N.D., Tanksley S.D. Restriction fragment length polymorphism maps and the concept of graphical genotypes. Theoretical and Applied Genetics. 1989;77(1):95-101. DOI: 10.1007/BF00292322

21. Zhang Z., Zhao H., Li W., Wu J., Zhou Z., Zhou F. et al. Genome-wide association study of callus induction variation to explore the callus formation mechanism of rice. Journal of Integrative Plant Biology. 2019;61(11):1134-1150. DOI: 10.1111/jipb.12759