Идентификация Tinomiscium petiolare из Вьетнама с помощью штрих-кода ДНК

Актуальность. Tinomiscium petiolare Hook.f. & Thomson (тиномисциум черешковый) – лекарственный вид семейства Menispermaceae Juss. (Луносемянниковые). Этот вид в настоящее время активно используется в лечебных целях. Точная и быстрая идентификация T. petiolare имеет решающее значение для классификации, размножения, использования и сохранения его генетических ресурсов. В последние годы стало известно, что ДНК-штрихкодирование является быстрым и чувствительным методом идентификации видов на любой стадии развития с использованием коротких последовательностей ДНК. В этом исследовании мы провели идентификацию образцов T. petiolare во Вьетнаме на основе анализа последовательностей ДНК-штрихкодов 4 локусов: ITS, matK, rbcL и rpoC.
Материалы и методы. Тотальную ДНК экстрагировали из образцов листьев с помощью DNeasy Plant Mini Kit. ПЦР-амплификацию участков ITS, matK, rbcL и rpoC проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 со специфическими праймерами. Очищенные продукты ПЦР секвенировали с помощью системы ABI 3500 Genetic Analyzer с использованием BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Полученные последовательности были проанализированы, сравнены, и построено филогенетическое дерево с помощью программ BioEdit, BLAST и MEGA 6.
Результаты и выводы. Степень результативности амплификации и секвенирования составила 100% для ДНК-штрихкодов всех 4 локусов (ITS, matK, rbcL и rpoC) исследуемых образцов. Размеры последовательностей ITS, matK, rbcL и rpoC исследуемых образцов, которые мы получили, составляли 574 пн, 810 пн, 527 пни 488 пн соответственно. Кроме того, мы определили, что все исследуемые образцы генетически связаны друг с другом и относятся к одному и тому же виду T. petiolare. В целом результаты исследования дали самую полную базу данных о ДНК-штрихкоде образцов T. petiolare, собранных во Вьетнаме, что способствовало идентификации и уточнению таксономии вида.

1. Balasubramani S.P., Venkatasubramanian P. Molecular identification and development of nuclear DNA ITS sequencebased marker to distinguish Coscinium fenestratum Gaertn. (Menispermaceae) from its adulterants. Current Trends in Biotechnology and Pharmacy. 2011;5(2):1163-1172.

2. Chen S., Yao H., Han J., Liu C., Song J., Shi L. et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One. 2010;5(1):e8613. DOI: 10.1371/journal.pone.0008613

3. Chi V.V. Dictionary of medicinal plants in Vietnam. Ho Chi Minh: Vietnam Publisher of Medicine; 2012. [in Vietnamese]

4. Chinh V.T., Quang B.H., Anh T.T.P. Morphological characteristics and key to genera of family Menispermaceae in Vietnam. In: Proceedings of the 6th National Scientific Conference of Ecology and Biological Resources (Hanoi, Vietnam); Hanoi; 2015. p.27-32.

5. Christenhusz M.J., Byng J.W. The number of known plants species in the world and its annual increase. Phytotaxa. 2016;261(3):201-217. DOI: 10.11646/phytotaxa.261.3.1

6. Ford C.S., Ayres K.L., Toomey N., Haider N., Van Alphen Stahl J., Kelly L.J. et al. Selection of candidate coding DNA barcoding regions for use on land plants. Botanical Journal of the Linnean Society. 2009;159(1):1-11. DOI: 10.1111/j.1095-8339.2008.00938.x

7. Forman L.L. A synopsis of Thai Menispermaceae. Kew Bulletin. 1988;43(3):369-407. DOI: 10.2307/4118970

8. Ghollasimood S., Faridah-Hanum I., Nazre M. Abundance and distribution of climbers in a coastal hill forest in Perak, Malaysia. Journal of Agricultural Science. 2012;4(5):245-254.

9. Hall T., Biosciences I., Carlsbad C. BioEdit: an important software for molecular biology. GERF Bulletin of Biosciences. 2011;2(1):60-61.

10. Hillis D.M., Dixon M.T. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference. The Quarterly Review of Biology. 1991;66(4):411-453. DOI: 10.1086/417338

11. Ho P.H. An illustrated flora of Vietnam. Vol. 1. Ho Chi Minh, Vietnam: Young Publishing House; 2000. [in Vietnamese]

12. Hollingsworth P.M., Graham S.W., Little D.P. Choosing and using a plant DNA barcode. PLoS One. 2011;6(5):e19254. DOI: 10.1371/journal.pone.0019254

13. Kress W.J. Plant DNA barcodes: Applications today and in the future. Journal of Systematics and Evolution. 2017;55(4):291-307. DOI: 10.1111/jse.12254

14. Kress W.J., Erickson D.L. A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region. PLoS One. 2007;2(6):e508. DOI: 10.1371/journal.pone.0000508

15. Kress W.J., Wurdack K.J., Zimmer E.A., Weigt L.A., Janzen D.H. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005;102(23):8369-8374. DOI: 10.1073/pnas.0503123102

16. Levin R.A., Wagner W.L., Hoch P.C., Nepokroeff M., Pires J.C., Zimmer E.A. et al. Family-level relationships of Onagraceae based on chloroplast rbcL and ndhF data. American Journal of Botany. 2003;90(1):107-115. DOI: 10.3732/ajb.90.1.107

17. McGinnis S., Madden T.L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Research. 2004;32 Suppl 2:W20-W25. DOI: 10.1093/nar/gkh435

18. Mishra P., Kumar A., Nagireddy A., Mani D.N., Shukla A.K., Tiwari R. et al. DNA barcoding: an efficient tool to overcome authentication challenges in the herbal market. Plant Biotechnology Journal. 2016;14(1):8-21. DOI: 10.1111/pbi.12419

19. NCBI. National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine. Bethesda, MD; 1988-2021. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ [accessed Aug. 31, 2020].

20. Osathanunkul M., Osathanunkul R., Madesis P. Species identification approach for both raw materials and end products of herbal supplements from Tinospora species. BMC Complementary and Alternative Medicine. 2018;18(1):111. DOI: 10.1186/s12906-018-2174-0

21. Selvaraj D., Shanmughanandhan D., Sarma R.K., Joseph J.C., Srinivasan R.V., Ramalingam S. DNA barcode ITS effectively distinguishes the medicinal plant Boerhavia diffusa from its adulterants. Genomics, Proteomics and Bioinformatics. 2012;10(6):364-367. DOI: 10.1016/j.gpb.2012.03.002

22. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 2013;30(12):2725-2729. DOI: 10.1093/molbev/mst197

23. Thinh B.B., Chac L.D., Thu L.T. Application of internal transcribed spacer (ITS) sequences for identifying Anoectochilus setaceus Blume in Thanh Hoa, Vietnam. Proceedings on Applied Botany, Genetics and Breeding. 2020;181(2):108-116. DOI: 10.30901/2227-8834-2020-2-108-116

24. Tripathi A.M., Tyagi A., Kumar A., Singh A., Singh S., Chaudha ry L. et al. The internal transcribed spacer (ITS) region and trnH-psbA are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India. PLoS One. 2013;8(2):e57934. DOI: 10.1371/journal.pone.0057934

25. Van Valkenburg J.L.C.H., Bunyapraphatsara N. Medicinal and poisonous plants 2. In: Plant Resources of SouthEast Asia. Vol 12(2). Leiden: Backhuys Publishers; 2001. p.550-552.

26. Wang X., Xue J., Zhang Y., Xie H., Wang Y., Weng W. et al. DNA barcodes for the identification of Stephania (Me nispermaceae) species. Molecular Biology Reports. 2020;47(3):2197-2203. DOI: 10.1007/s11033-020-05325-6

27. White T.J., Bruns T., Lee S., Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, T.J. White (eds). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. London: Academic Press; 1990. p.315-322.

28. Yang P., Li X., Zhou H., Hu H., Zhang H., Sun W., et al. Molecular identification of Chinese materia medica and its adulterants using ITS2 and psbA-trnH Barcodes: a case study on Rhizoma Menispermi. Chinese Medicine. 2014;5(4):1-8. DOI: 10.4236/cm.2014.54023