Сборка генома Vitis rotundifolia Michx. с использованием методов секвенирования третьего поколения (Oxford Nanopore Technologies)

Североамериканский иммунный к болезням вид винограда Vitis rotundifolia Michx. (подрод Muscadinia Planch.) рассматривается как потенциальный донор генов устойчивости к опасным болезням винограда – оидиуму и милдью. Сорт ‘Dixie’ – единственный представитель вида V. rotundifolia, сохраняемый в коллекциях ex situ на территории России, а именно в коллекции Всероссийского института генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова (ВИР) в полевых условиях Крымской опытно-селекционной станции – филиала ВИР.
Для получения информации о первичной структуре фрагментов геномной ДНК данного сорта был использован метод секвенирования третьего поколения на платформе MinION, а также привлечены результаты секвенирования на платформе Illumina, имеющиеся в базах данных.
В статье представлено подробное описание последовательности действий для секвенирования генома винограда и полногеномной сборки. Модифицированный метод включает основные этапы оригинальной методики, рекомендованной производителем MinION: 1) выделение ДНК; 2) подготовка библиотек для секвенирования; 3) секвенирование на MinION и биоинформатическая обработка данных; 4) полногеномная сборка методом de novo (сборка с использованием данных ONT и сборка с комбинацией данных ONT и Illumina); 5) оценка качества полногеномной сборки. Этап 4 включал не только секвенирование de novo, но и анализ имеющихся биоинформатических данных, что позволило уменьшить ошибки и повысить точность при сборке изучаемого генома. ДНК, выделенная из листьев сорта ‘Dixie’, была секвенирована с использованием двух ячеек MinION типа R9.4.1.

1. Antipov D., Hartwick N., Shen M., Raiko M., Lapidus A., Pevzner P.A. PlasmidSPAdes: assembling plasmids from whole genome sequencing data. Bioinformatics. 2016;32(22):3380-3387. DOI: 10.1093/bioinformatics/btw493

2. Barker C.L., Donald T., Pauquet J., Ratnaparkhe M.B., Bouquet A., Adam-Blondon A.F. et al. Genetic and physical mapping of the grapevine powdery mildew resistance gene, Run1, using a bacterial artificial chromosome library. Theoretical and Applied Genetics. 2005;111(2):370-377. DOI: 10.1007/s00122-005-2030-8

3. Canaguier C.A., Grimplet J., Di Gaspero G., Scalabrin S., Duchêne E., Choisne N. et al. A new version of the grapevine reference genome assembly (12X. v2) and of its annotation (VCost. v3). Genomics Data. 2017;14:56-62. DOI: 10.1016/j.gdata.2017.09.002

4. Cochetel N., Minio A., Massonnet M., Vondras A., FigueroaBalderas R., Cantu D. Diploid chromosome-scale assembly of the Muscadinia rotundifolia genome supports chromosome fusion and disease resistance gene expansion during Vitis and Muscadinia divergence. G3 (Bethesda). 2021;11(4):jkab033. DOI: 10.1093/g3journal/jkab033

5. De Coster W., D’Hert S., Schultz D.T., Cruts M., Van Broeckhoven Ch. NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data. Bioinformatics. 2018;34(15):2666-2669. DOI: 10.1093/bioinformatics/bty149

6. De Maio N., Shaw L.P., Hubbard A., George S., Sanderson N.D., Swann J. et al. Comparison of long-read sequencing technologies in the hybrid assembly of complex bacterial genomes. Microbial Genomics. 2019;5(9):e000294. DOI: 10.1099/mgen.0.000294 de.NBI Nanopore Training Course. The Tutorial Data Set. Basecalling. 2019. Available from: https://denbi-nanopore-training-course.readthedocs.io/en/latest/basecalling/index.html [accessed Dec. 10, 2020].

7. Ewing B., Green P. Base-calling of automated sequencer traces using Phred. II. Error probabilities. Genome Research. 1998;8(3):186-194. DOI: 10.1101/gr.8.3.186

8. Grigoreva E., Ulianich P., Ben C., Gentzbittel L., Potokina E. First insights into the guar (Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub.) genome of the ‘Vavilovskij 130’ accession, using second and third-generation sequencing technologies. Russian Journal of Genetics. 2019;55(11):1406-1416. DOI: 10.1134/S102279541911005X

9. Gurevich A., Saveliev V., Vyahhi N., Tesler G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 2013;29(8):1072-1075. DOI: 10.1093/bioinformatics/btt086

10. Leger A., Leonardi T. PycoQC, interactive quality control for Oxford Nanopore Sequencing. Journal of Open Source Software. 2019;4(34):1236. DOI: 10.21105/joss.01236

11. Li H. Minimap and miniasm: fast mapping and de novo assembly for noisy long sequences. Bioinformatics. 2016;32(14):2103-2110. DOI: 10.1093/bioinformatics/btw152

12. Li H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 2018;34(18):3094-3100. DOI; 10.1093/bioinformatics/bty191

13. Loman N.J., Quinlan A.R. Poretools: a toolkit for analyzing nanopore sequence data. Bioinformatics. 2014;30(23): 3399-3401. DOI: 10.1093/bioinformatics/btu555

14. NCBI: National Center for Biotechnology Information. Bioproject 649974. Vitis rotundifolia cultivar: Dixie. Vitis rotundifolia Michx. whole genome sequencing and assembly using nanopore technology (Oxford Nanopore Technologies). Accession: PRJNA649974. Registration date: Nov. 10, 2020. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/649974 [accessed Dec. 07, 2020].

15. Seppey M., Manni M., Zdobnov E.M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness. Methods in Molecular Biology. 2019;1962:227-245. DOI: 10.1007/978-1-4939-9173-0_14

16. Simão F.A., Waterhouse R.M., Ioannidis P., Kriventseva E.V., Zdobnov E.M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 2015;31(19):3210-3212. DOI: 10.1093/bioinformatics/btv351

17. Stanke M., Keller O., Gunduz I., Hayes A., Waack S., Morgenstern B. AUGUSTUS: ab initio prediction of alternative transcripts. Nucleic acids research. 2006;34 Suppl 2:W435-W439. DOI: 10.1093/nar/gkl200

18. Tarailo-Graovac M., Chen N. Using RepeatMasker to identify repetitive elements in genomic sequences. Current Protocols in Bioinformatics. 2009;25(1):4.10.1-4.10.14. DOI: 10.1002/0471250953.bi0410s25

19. Vaser R., Sović I., Nagarajan N., Šikić M. Fast and accurate de novo genome assembly from long uncorrected reads. Genome Research. 2017;27(5):737-746. DOI: 10.1101/gr.214270.116

20. Волынкин В.А. Зленко В.А., Популях А.А., Олейников Н.П., Лиховской В.В. Результаты экспериментальных исследований формирования генетического разнообразия у семейства винограда Vitaceae в процессе естественной эволюции. Магарач. Виноградарство и виноделие. 2010;40:12-16.

21. Walker B.J., Abeel T., Shea T., Priest M., Abouelliel A., Sakthikumar Sh. et al. Pilon: an integrated tool for comprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement. PLoS One. 2014;9(11):e112963. DOI: 10.1371/journal.pone.0112963

22. Wick R.R., Judd L.M., Holt K.E. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 2019;20(1):129. DOI: 10.1186/s13059-019-1727-y

23. Zini E., Dolzani Ch., Stefanini M., Gratl V., Bettinelli P., Nicolini D. et al. R-loci arrangement versus downy and powdery mildew resistance level: A Vitis hybrid survey. International Journal of Molecular Sciences. 2019;20(14):3526. DOI: 10.3390/ijms20143526