Разработка высокоинформативных микросателлитных маркеров для генетического анализа подсолнечника

Актуальность. Маркеры микросателлитных локусов, используемые для изучения генетического разнообразия подсолнечника и его идентификации, обладают рядом ограничений. Необходимо создание новых маркеров с три- и более длинным нуклеотидным мотивом, строгой специфичностью к целевому локусу и высоким дискриминационным потенциалом.

Материалы и методы. Поиск микросателлитных локусов проводили с использованием программы GMATA по последовательности эталонной сборки генома подсолнечника HanXRQr2.0-SUNRISE. Локусы с фланкирующими областями проверили на наличие копий в других хромосомах с помощью Nucleotide BLAST и провели подбор пар праймеров с помощью Primer-BLAST (NCBI). Предполагаемый полиморфизм микросателлитного локуса оценили путем выравнивания ожидаемого продукта ПЦР на другие сборки геномов подсолнечника из базы GenBank с помощью Nucleotide BLAST. Апробация разработанных маркеров осуществлена с помощью ПЦР и разделения продуктов амплификации методом капиллярного электрофореза в денатурирующих условиях.

Результаты. Всего разработано 186 маркеров. Из них 16 характеризовались неспецифичной амплификацией, 31 – полным отсутствием амплификации, у 26 выявлены артефакты SSR-анализа, а 19 не выявили полиморфизм. Остальные 94 маркера оказались информативными и выявили от 2 до 6 аллелей. Диапазон длин амплифицированных фрагментов ДНК составил от 125 до 469 пн. Выявлена статистически значимая взаимосвязь между количеством повторов в микросателлитном локусе и числом аллелей.

Заключение. На основании полученных данных возможен отбор наиболее информативных маркеров для формирования мультиплексных ПЦР и создания эффективной системы генотипирования подсолнечника.

1. Ahmed H.G.M.D., Rizwan M., Naeem M., Khan M.A., Baloch F.S., Sun S. et al. Molecular characterization and validation of sunflower (Helianthus annuus L.) hybrids through SSR markers. PLoS One. 2022;17(5):e0267383. DOI: 10.1371/journal.pone.0267383

2. Ascunce M.S., Toups M.A., Kassu G., Fane J., Scholl K., Reed D.L. Nuclear genetic diversity in human lice (Pediculus humanus) reveals continental differences and high inbreeding among worldwide populations. PLoS One. 2013;8(2):e57619. DOI:10.1371/journal.pone.0057619

3. Avvaru A.K., Sharma D., Verma A., Mishra R.K., Sowpati D.T. MSDB: a comprehensive, annotated database of microsatellites. Nucleic Acids Research. 2020;48(D1):D155-D159. DOI: 10.1093/nar/gkz886

4. Brunel D. A microsatellite marker in Helianthus annuus L. Plant Molecular Biology. 1994;24(2):397-400. DOI: 10.1007/BF00020177

5. Buchan J.C., Archie E.A., Van Horn R.C., Moss C.J., Alberts S.C. Locus effects and sources of error in noninvasive genotyping. Molecular Ecology Notes. 2005;5(3):680-683. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2005.01002.x

6. Camacho C., Coulouris G., Avagyan V., Ma N., Papadopoulos J., Bealer K. et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 2009;10:421. DOI: 10.1186/1471-2105-10-421

7. Cohen J. Statistical power analysis for the behavioral sciences. 2nd ed. New York, NY: Routledge; 1988. DOI: 10.4324/9780203771587

8. Fallah M., Paizila A., Karcı H., Arab M.M., Sarikhani S., Suprun I. et al. Validation and implementation of marker-assisted selection (MAS) for the leafing date trait in Persian walnut populations from Iran. Euphytica. 2024;220(2):25. DOI: 10.1007/s10681-023-03281-3

9. Filippi C., Aguirre N., Rivas J.G., Zubrzycki J., Puebla A., Cordes D. et al. Population structure and genetic diversity characterization of a sunflower association mapping population using SSR and SNP markers. BMC Plant Biology. 2015;15:52. DOI: 10.1186/s12870-014-0360-x

10. Головатская А.В., Гучетль С.З. Оценка генетического разнообразия линий подсолнечника селекции ВНИИМК на основе мультиплексного микросателлитного анализа. Аграрная наука. 2024;(11):117-121. DOI: 10.32634/0869-8155-2024-388-11-117-121

11. Головатская А.В., Гучетль С.З. Скрининг микросателлитных ДНК-маркеров для разработки эффективной системы идентификации подсолнечника. Кормопроизводство. 2023;(11):48-51. DOI: 10.25685/krm.2023.11.2023.007

12. Головатская А.В, Гучетль С.З., Савиченко Д.Л., Логинова Е.Д., Жудина Э.И. База данных микросателлитных ДНК-маркеров подсолнечника (Helianthus annuus L.). Российская Федерация; свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2025622192; 2025. URL: https://vniimk.ru/science/bazy-dannykh-i-programmy-dlya-evm/ljrevtyns-2 [дата обращения: 22.06.2024].

13. Гучетль С.З., Головатская А.В., Рамазанова С.А., Волошко А.А. Генетическое разнообразие линий подсолнечника российской селекции, выявленное с помощью анализа микросателлитных локусов. Аграрная наука Евро-Северо-Востока. 2023;24(2):173-186. DOI: 10.30766/2072-9081.2023.24.2.173-186

14. Guichoux E., Lagache L., Wagner S., Chaumeil P., Léger P., Lepais O. et al. Current trends in microsatellite genotyping. Molecular Ecology Resources. 2011;11(4):591-611. DOI: 10.1111/j.1755-0998.2011.03014.x

15. Hoffman J.I., Amos W. Microsatellite genotyping errors: detection approaches, common sources and consequences for paternal exclusion. Molecular Ecology. 2005;14(2):599-612. DOI: 10.1111/j.1365-294X.2004.02419.x

16. Liu C., Zhao N., Jiang Z.C., Zhang H., Zhai H., He S.Z. et al. Analysis of genetic diversity and population structure in sweetpotato using SSR markers. Journal of Integrative Agriculture. 2023;22(11):3408-3415. DOI: 10.1016/j.jia.2023.02.004

17. Mason A.S. SSR genotyping. In: J. Batley (ed.). Methods in Molecular Biology. Vol. 1245. Plant Genotyping. New York, NY: Humana Press; 2015. p.77-89. DOI: 10.1007/978-1-4939-1966-6_6

18. NIH. National Library of Medicine. National Center for Biotechnology Information: [website]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov [accessed Mar. 25, 2025].

19. NIH. National Library of Medicine. National Center for Biotechnology Information. Primer-BLAST: A tool for finding specific primers: [website]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast [accessed Mar. 25, 2025].

20. Paniego N., Echaide M., Muñoz M., Fernández L., Torales S., Faccio P. et al. Microsatellite isolation and characterization in sunflower (Helianthus annuus L.). Genome. 2002;45(1):34-43. DOI: 10.1139/g01-120

21. Ramazanova S.A., Badyanov E.V., Guchetl S.Z. Validation of microsatellite markers to identify Pl6, Pl8 and Plarg genes that control resistance to Plasmopara halstedii in sunflower. Caspian Journal of Environmental Sciences. 2021;19(5):915-920. DOI: 10.22124/CJES.2021.5266

22. Ramya K.T., Vishnuvardhan Reddy A., Sujatha M. Agromorphological and molecular analysis discloses wide genetic variability in sunflower breeding lines from USDA, USA. Indian Journal of Genetics and Plant Breeding. 2019;79(2):444-452. DOI: 10.31742/IJGPB.79.2.8

23. Шеллер М.А. Чиокырлан Е., Михайлов П.В., Кулаков С.С., Кулакова Н.Н., Ибе А.А. и др. Генетическое разнообразие сосны обыкновенной (P. sylvestris L.) в средней Сибири по результатам анализа изменчивости хлоропластных микросателлитных локусов. Биосфера. Междисциплинарный научный и прикладной журнал. 2023;15(4):343-348. DOI: 10.24855/biosfera.v15i4.868

24. Шилов И.А., Велишаева Н.С., Анискина Ю.В., Колобова О.С., Шалаева Т.В., Борисенко О.М. и др. Генетическая идентификация линий и гибридов подсолнечника Helianthus annuus L. на основе мультиплексного микросателлитного анализа. Достижения науки и техники АПК. 2023;37(1):10-15. DOI: 10.53859/02352451_2023_37_1_10

25. Tang S., Yu J.K., Slabaugh B., Shintani D.K., Knapp S.J. Simple sequence repeat map of the sunflower genome. Theoretical and Applied Genetics. 2002;105(8):1124-1136. DOI: 10.1007/s00122-002-0989-y

26. The R Project for Statistical Computing: [website]. Available from: https://www.r-project.org [accessed Mar. 25, 2025].

27. Topu M., Sesiz U., Bektaş H., Toklu F., Özkan H. Next-generation-sequencing-based simple sequence repeat (SSR) marker development and linkage mapping in lentil (Lens culinaris L.). Life (Basel). 2023;13(7):1579. DOI: 10.3390/life13071579

28. Verbiest M., Maksimov M., Jin Y., Anisimova M., Gymrek M., Bilgin S.T. Mutation and selection processes regulating short tandem repeats give rise to genetic and phenotypic diversity across species. Journal of Evolutionary Biology. 2023;36(2):321-336. DOI: 10.1111/jeb.14106

29. Wang X., Wang L. GMATA: an integrated software package for genome-scale SSR mining, marker development and viewing. Frontiers in Plant Science. 2016;7:1350. DOI: 10.3389/fpls.2016.01350

30. Wickham H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. New York, NY: Springer-Verlag; 2016. DOI: 10.1007/978-0-387-98141-3

31. Yadav S., Carvalho J., Trujillo I., Prado M. Microsatellite markers in olives (Olea europaea L.): Utility in the cataloging of germplasm, food authenticity and traceability studies. Foods. 2021;10(8):1907. DOI: 10.3390/foods10081907