Оптимизация методики выделения ДНК для изучения генетического разнообразия эфиромасличных роз (Rosa L.)

Актуальность. Эфиромасличные розы содержат большое количество органических веществ, ухудшающих очистку ДНК при выделении. Для связывания этих соединений во многих протоколах экстракции ДНК используют токсичные вещества (фенол, меркаптоэтанол). В связи с этим целесообразно оптимизировать методику выделения ДНК из эфиромасличных роз.
Материал и методы. В работе использовались образцы роз из Ботанического сада Крымского федерального университета, а также образцы из коллекции эфиромасличных роз селекционно-семеноводческого центра эфиромасличных культур НИИСХ Крыма. Выделение ДНК проводилось по модифицированному СТАВ-протоколу. Эффективность методики оценивалась методами спектрофотометрии, горизонтального электрофореза и постановкой ISSR-ПЦР.
Результаты. Препараты ДНК, выделенные модифицированным методом, хорошо визуализируются на электрофореграмме и имеют высокие спектрофотометрические показатели. Содержание ДНК в два раза выше в препаратах, полученных с использованием буфера для экстракции с ПВП, по сравнению с буфером без ПВП. Также концентрация выше в препаратах ДНК, выделенных из стеблей, чем из листьев. Параметры чистоты, выражаемые отношением поглощения на длинах волн А_260/280 и А_260/230, также выше у препаратов ДНК, экстрагированных из стеблей с обогащенным буфером, причем соотношение А_260/230 входит в диапазон нормы только в препаратах ДНК, выделенных из стеблей в присутствии ПВП. При этом очистка от белков эффективна без применения фенола и меркаптоэтанола благодаря двукратной промывке смесью хлороформа и изоамилового спирта (24 : 1).
Заключение. Использование ткани стеблей в качестве материала для исследований, добавление поливинилпирролидона (ПВП) в концентрации 2% в буфер для экстракции, а также повторная промывка смесью хлороформа и изоамилового спирта позволяют получить препараты ДНК с высокой концентрацией и показателями чистоты, входящими в диапазоны нормы, пригодные для изучения генетического разнообразия эфиромасличных роз методом ISSR-анализа.

1. Бриштен А.М., Василевич И.В. Сравнительная характеристика выделенной ДНК протоколом «ЦТАБ- PVP- меркаптоэтанол» из разных органов (почка, лист, стебель) растений. В кн.: Научный потенциал молодежи – будущему Беларуси: материалы XV международной молодежной научно–практической конференции; г. Пинск; 9 апреля 2021 г. Пинск: Полесский государственный университет; 2021. С.62-64.

2. Dairawan M., Shetty P.J. The evolution of DNA extraction methods. American Journal of Biomedical Science and Research. 2020;8(1):39-45. DOI: 10.34297/AJBSR.2020.08.001234

3. Demeke T., Ratnayaka I., Phan A. Effects of DNA extraction and purification methods on real-time quantitative PCR analysis of Roundup Ready soybean. Journal of AOAC International. 2009;92(4):1136-1144. DOI: 10.1093/jaoac/92.4.1136

4. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 1987;19(1):11-15.

5. Godwin I.D., Aitken E.A.B., Smith L.W. Application of inter simple sequence repeat (ISSR) markers to plant genetics. Electrophoresis. 1997;18(9):1524-1528. DOI: 10.1002/elps.1150180906

6. Hu C.G., Honda C., Kita M., Zhang Z., Tsuda T., Moriguchi T. A simple protocol for RNA isolation from fruit trees containing high levels of polysaccharides and polyphenol compounds. Plant Molecular Biology Reporter. 2002;20(1):69. DOI: 10.1007/BF02801935

7. Huang Q.X., Wang X.C., Kong H., Guo Y.L. Guo A.С. An efficient DNA isolation method for tropical plants. African Journal of Biotechnology. 2013;12(19):2727-2732. DOI: 10.5897/AJB12.524

8. Jabbarzadeh Z., Khosh-Khui M., Salehi H., Saberivand A. Optimization of DNA extraction for ISSR studies in seven important rose species of Iran. American-Eurasian Journal of Sustainable Agriculture. 2009;3(4):639-642.

9. Khanuja S.P.S., Shasany A.K., Darokar M.P., Kumar S. Rapid isolation of DNA from dry and fresh samples of plants producing large amounts of secondary metabolites and essential oils. Plant molecular biology Reporter. 1999;17(1):74. DOI: 10.1023/A:1007528101452

10. Кутлунина Н.А., Ермошин А.А. Молекулярно-генетические методы в исследовании растений: учебно-методическое пособие. Екатеринбург: Издательство Уральского университета; 2017.

11. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 1980;8(19):4321-4325. DOI: 10.1093/nar/8.19.4321

12. Назаренко Л.Г., Коршунов В.А., Кочетков Е.С. Эфиромасличное розоводство / под ред. Л.Г. Назаренко. Симферополь: Таврия; 2006.

13. Рябушкина Н.А., Омашева М.Е., Галиакпаров Н.Н. Специфика выделения ДНК из растительных объектов. Биотехнология. Теория и практика. 2012;(2):9-26. DOI: 10.11134/btp.2.2012.1

14. Sahu S.K., Thangaraj M., Kathiresan K. DNA extraction protocol for plants with high levels of secondary metabolites and polysaccharides without using liquid nitrogen and phenol. ISRN Molecular Biology. 2012;2012:205049. DOI: 10.5402/2012/205049

15. НТИРФ. Коллекции эфирномасличных, пряно–ароматических и лекарственных растений: [сайт]. URL: https://ckp-rf.ru/usu/507515/ [дата обращения 10.02.2023].

16. Сухарева А.С., Кулуев Б.Р. ДНК-маркеры для генетического анализа сортов культурных растений. Биомика. 2018;10(1):69-84. DOI: 10.31301/2221-6197.bmcs.2018-15

17. Suprun I.I., Plugatar S.A., Stepanov I.V., Naumenko T.S. Analysis of genetic relationships of genotypes of the genus Rosa L. from the collection of Nikita Botanical Gardens using ISSR and IRAP DNA markers. Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2020;24(5):474-480. DOI: 10.18699/VJ20.639

18. Tiwari S., Tomar R.S., Tripathi M.K., Ahuja A. Modified protocol for plant genomic DNA isolation. Indian Research Journal of Genetics and Biotechnology. 2017;9(4):478-485.

19. Водчиц Н.В., Зайцева И.О., Кирикович И.Г., Юрченко Е.О., Волотович А.А. Сравнительный анализ методов экстракции общей геномной ДНК голубики высокорослой. Вестник Полесского государственного университета. Серия природоведческих наук. 2014;(2):25-30.

20. Епринцев А.Т., Попов В.Н., Федорин Д.Н. Идентификация и исследование экспрессии генов: учебно-методическое пособие для вузов. Воронеж: Воронежский государственный университет; 2008)

21. Золотилов В.А., Невкрытая Н.В. Закладка и эксплуатация маточников розы эфиромасличной: методические рекомендации. Симферополь: НИИСХ Крыма; 2017.