vir-nwТруды по прикладной ботанике, генетике и селекцииProceedings on applied botany, genetics and breeding2227-88342619-0982N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources10.30901/2227-8834-2025-4-142-154vir-nw-2354Research ArticleИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ КУЛЬТУРНЫХ РАСТЕНИЙ И ИХ ДИКИХ РОДИЧЕЙ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПРИКЛАДНЫХ ПРОБЛЕМIDENTIFICATION OF THE DIVERSITY OF CULTIVATED PLANTS AND THEIR WILD RELATIVES FOR SOLVING FUNDAMENTAL AND APPLIED PROBLEMSРазработка высокоинформативных микросателлитных маркеров для генетического анализа подсолнечникаDevelopment of highly informative microsatellite markers for the genetic analysis of sunflowerhttps://orcid.org/0000-0002-2193-5230ГучетльС. З.GuchetlS. Z.

Саида Заурбиевна Гучетль, кандидат биологических наук, заведующая лабораторией

350038 Россия, Краснодар, ул. Филатова, 17

Saida Z. Guchetl, Cand. Sci. (Biology), Head of a Laboratory

17 Filatova St., Krasnodar 350038, Russia

saida.guchetl@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8355-3150ГоловатскаяА. В.GolovatskayaA. V.

Анна Владимировна Головатская, младший научный сотрудник

350038 Россия, Краснодар, ул. Филатова, 17

Anna V. Golovatskaya, Associate Researcher

17 Filatova St., Krasnodar 350038, Russia

annamoon11@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-8457-2919СавиченкоД. Л.SavichenkoD. L.

Дмитрий Леонидович Савиченко, научный сотрудник

350038 Россия, Краснодар, ул. Филатова, 17

Dmitrii L. Savichenko, Researcher

17 Filatova St., Krasnodar 350038, Russia

d_savichenko@mail.ruhttps://orcid.org/0009-0002-5136-1028ЛогиноваЕ. Д.LoginovaE. D.

Елизавета Дмитриевна Логинова, младший научный сотрудник

350038 Россия, Краснодар, ул. Филатова, 17

Elizaveta D. Loginova, Associate Researcher

17 Filatova St., Krasnodar 350038, Russia

asdfghjklis@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0244-0926ЖудинаЭ. И.ZhudinaE. I.

Эльвина Исмаиловна Жудина, аналитик

350038 Россия, Краснодар, ул. Филатова, 17

Elvina I. Zhudina, Analyst

17 Filatova St., Krasnodar 350038, Russia

Elvinaalieva98.98@mail.ruВсероссийский научно-исследовательский институт масличных культур им. В.С. ПустовойтаРоссияV.S. Pustovoit All-Russia Research Institute of Oil CropsRussian FederationВсероссийский научно-исследовательский институт масличных культур имени В.С. ПустовойтаРоссияV.S. Pustovoit All-Russia Research Institute of Oil CropsRussian Federation2025271220251864142154Copyright © Гучетль С.З., Головатская А.В., Савиченко Д.Л., Логинова Е.Д., Жудина Э.И., 20252025Гучетль С.З., Головатская А.В., Савиченко Д.Л., Логинова Е.Д., Жудина Э.И.Guchetl S.Z., Golovatskaya A.V., Savichenko D.L., Loginova E.D., Zhudina E.I.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://elpub.vir.nw.ru/jour/article/view/2354Актуальность

Актуальность. Маркеры микросателлитных локусов, используемые для изучения генетического разнообразия подсолнечника и его идентификации, обладают рядом ограничений. Необходимо создание новых маркеров с три- и более длинным нуклеотидным мотивом, строгой специфичностью к целевому локусу и высоким дискриминационным потенциалом.

Материалы и методы

Материалы и методы. Поиск микросателлитных локусов проводили с использованием программы GMATA по последовательности эталонной сборки генома подсолнечника HanXRQr2.0-SUNRISE. Локусы с фланкирующими областями проверили на наличие копий в других хромосомах с помощью Nucleotide BLAST и провели подбор пар праймеров с помощью Primer-BLAST (NCBI). Предполагаемый полиморфизм микросателлитного локуса оценили путем выравнивания ожидаемого продукта ПЦР на другие сборки геномов подсолнечника из базы GenBank с помощью Nucleotide BLAST. Апробация разработанных маркеров осуществлена с помощью ПЦР и разделения продуктов амплификации методом капиллярного электрофореза в денатурирующих условиях.

Результаты

Результаты. Всего разработано 186 маркеров. Из них 16 характеризовались неспецифичной амплификацией, 31 – полным отсутствием амплификации, у 26 выявлены артефакты SSR-анализа, а 19 не выявили полиморфизм. Остальные 94 маркера оказались информативными и выявили от 2 до 6 аллелей. Диапазон длин амплифицированных фрагментов ДНК составил от 125 до 469 пн. Выявлена статистически значимая взаимосвязь между количеством повторов в микросателлитном локусе и числом аллелей.

Заключение

Заключение. На основании полученных данных возможен отбор наиболее информативных маркеров для формирования мультиплексных ПЦР и создания эффективной системы генотипирования подсолнечника.

Background

Background. The existing microsatellite loci markers, used for studying and identifying sunflower genetic diversity, have certain limitations. There is a need for new markers that will meet the following criteria: three or more nucleotides in the microsatellite motif, specificity to the target locus, and high discriminatory power.

Materials and methods

Materials and methods. Microsatellite loci were mined using the GMATA software based on the reference genome assembly of sunflower HanXRQr2.0-SUNRISE. Loci with flanking regions were screened for the presence of copies on other chromosomes using Nucleotide BLAST, and primer pairs were designed using Primer-BLAST (NCBI). The expected polymorphism of each microsatellite locus was evaluated by aligning the predicted PCR product to other sunflower genome assemblies from the GenBank database using Nucleotide BLAST. The performance of the developed markers was tested by PCR and separation of amplification products by capillary electrophoresis under denaturing conditions.

Results

Results. A total of 186 markers were developed. Of these, 16 were characterized by nonspecific amplification, 31 showed complete absence of amplification, 26 revealed SSR-specific artifacts, and 19 were monomorphic. The remaining 94 markers were informative and detected from 2 to 6 alleles. Among the selected sequences, simple microsatellites with trinucleotide motifs were the most prevalent. The number of markers per chromosome ranged from 2 to 19. The size range of the amplified DNA fragments was from 125 to 469 bp. A statistically significant correlation was found between the number of repeats in the microsatellite locus and the number of detected alleles.

Conclusion

Conclusion. The obtained data make it possible to select the most informative markers for the development of multiplex SSR assays and the establishment of an effective genotyping system for sunflower.

Helianthus annuusSSR-локусыидентификациягенотипированиеHelianthus annuusmicrosatellitesidentificationgenotypingРабота выполнена в рамках реализации государственных заданий Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур им. В.С. Пустовойта № 082-3-2023-0002 «Разработка технологии генетической идентификации и паспортизации линий и гибридов подсолнечника с использованием системы маркеров микросателлитных локусов ДНК». Авторы благодарят рецензентов за их вклад в экспертную оценку этой работы.The research was carried out within the framework of the state tasks assigned to the V.S. Pustovoit All-Russia Research Institute of Oil Crops, Project No. 082-3-2023-0002 “Development of technology for genetic identification and certification of sunflower lines and hybrids using a system of DNA microsatellite loci markers”. The authors thank the reviewers for their contribution to the peer review of this work.ReferencesAhmed H.G.M.D., Rizwan M., Naeem M., Khan M.A., Baloch F.S., Sun S. et al. Molecular characterization and validation of sunflower (Helianthus annuus L.) hybrids through SSR markers. PLoS One. 2022;17(5):e0267383. DOI: 10.1371/journal.pone.0267383Ahmed H.G.M.D., Rizwan M., Naeem M., Khan M.A., Baloch F.S., Sun S. et al. Molecular characterization and validation of sunflower (Helianthus annuus L.) hybrids through SSR markers. PLoS One. 2022;17(5):e0267383. DOI: 10.1371/journal.pone.0267383Ascunce M.S., Toups M.A., Kassu G., Fane J., Scholl K., Reed D.L. Nuclear genetic diversity in human lice (Pediculus humanus) reveals continental differences and high inbreeding among worldwide populations. PLoS One. 2013;8(2):e57619. DOI:10.1371/journal.pone.0057619Ascunce M.S., Toups M.A., Kassu G., Fane J., Scholl K., Reed D.L. Nuclear genetic diversity in human lice (Pediculus humanus) reveals continental differences and high inbreeding among worldwide populations. PLoS One. 2013;8(2):e57619. DOI:10.1371/journal.pone.0057619Avvaru A.K., Sharma D., Verma A., Mishra R.K., Sowpati D.T. MSDB: a comprehensive, annotated database of microsatellites. Nucleic Acids Research. 2020;48(D1):D155-D159. DOI: 10.1093/nar/gkz886Avvaru A.K., Sharma D., Verma A., Mishra R.K., Sowpati D.T. MSDB: a comprehensive, annotated database of microsatellites. Nucleic Acids Research. 2020;48(D1):D155-D159. DOI: 10.1093/nar/gkz886Brunel D. A microsatellite marker in Helianthus annuus L. Plant Molecular Biology. 1994;24(2):397-400. DOI: 10.1007/BF00020177Brunel D. A microsatellite marker in Helianthus annuus L. Plant Molecular Biology. 1994;24(2):397-400. DOI: 10.1007/BF00020177Buchan J.C., Archie E.A., Van Horn R.C., Moss C.J., Alberts S.C. Locus effects and sources of error in noninvasive genotyping. Molecular Ecology Notes. 2005;5(3):680-683. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2005.01002.xBuchan J.C., Archie E.A., Van Horn R.C., Moss C.J., Alberts S.C. Locus effects and sources of error in noninvasive genotyping. Molecular Ecology Notes. 2005;5(3):680-683. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2005.01002.xCamacho C., Coulouris G., Avagyan V., Ma N., Papadopoulos J., Bealer K. et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 2009;10:421. DOI: 10.1186/1471-2105-10-421Camacho C., Coulouris G., Avagyan V., Ma N., Papadopoulos J., Bealer K. et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 2009;10:421. DOI: 10.1186/1471-2105-10-421Cohen J. Statistical power analysis for the behavioral sciences. 2nd ed. New York, NY: Routledge; 1988. DOI: 10.4324/9780203771587Cohen J. Statistical power analysis for the behavioral sciences. 2nd ed. New York, NY: Routledge; 1988. DOI: 10.4324/9780203771587Fallah M., Paizila A., Karcı H., Arab M.M., Sarikhani S., Suprun I. et al. Validation and implementation of marker-assisted selection (MAS) for the leafing date trait in Persian walnut populations from Iran. Euphytica. 2024;220(2):25. DOI: 10.1007/s10681-023-03281-3Fallah M., Paizila A., Karcı H., Arab M.M., Sarikhani S., Suprun I. et al. Validation and implementation of marker-assisted selection (MAS) for the leafing date trait in Persian walnut populations from Iran. Euphytica. 2024;220(2):25. DOI: 10.1007/s10681-023-03281-3Filippi C., Aguirre N., Rivas J.G., Zubrzycki J., Puebla A., Cordes D. et al. Population structure and genetic diversity characterization of a sunflower association mapping population using SSR and SNP markers. BMC Plant Biology. 2015;15:52. DOI: 10.1186/s12870-014-0360-xFilippi C., Aguirre N., Rivas J.G., Zubrzycki J., Puebla A., Cordes D. et al. Population structure and genetic diversity characterization of a sunflower association mapping population using SSR and SNP markers. BMC Plant Biology. 2015;15:52. DOI: 10.1186/s12870-014-0360-xГоловатская А.В., Гучетль С.З. Оценка генетического разнообразия линий подсолнечника селекции ВНИИМК на основе мультиплексного микросателлитного анализа. Аграрная наука. 2024;(11):117-121. DOI: 10.32634/0869-8155-2024-388-11-117-121Golovatskaya А.V., Guchetl S.Z. Assessment of the genetic diversity of sunflower lines of VNIIMK breeding based on multiplex microsatellite analysis. Agrarian Science. 2024;(11):117-121. [in Russian]. DOI: 10.32634/0869-8155-2024-388-11-117-121Головатская А.В., Гучетль С.З. Скрининг микросателлитных ДНК-маркеров для разработки эффективной системы идентификации подсолнечника. Кормопроизводство. 2023;(11):48-51. DOI: 10.25685/krm.2023.11.2023.007Golovatskaya А.V., Guchetl S.Z. Screening of microsatellite DNA markers for effective sunflower identification. Fodder Production. 2023;(11):48-51. [in Russian]. DOI: 10.25685/krm.2023.11.2023.007Головатская А.В, Гучетль С.З., Савиченко Д.Л., Логинова Е.Д., Жудина Э.И. База данных микросателлитных ДНК-маркеров подсолнечника (Helianthus annuus L.). Российская Федерация; свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2025622192; 2025. URL: https://vniimk.ru/science/bazy-dannykh-i-programmy-dlya-evm/ljrevtyns-2 [дата обращения: 22.06.2024].Golovatskaya А.V., Guchetl S.Z., Savichenko D.L., Loginova E.D., Zhudina E.I. Database of microsatellite DNA markers of sunflower (Helianthus annuus L.). Russian Federation; database state registration certificate number: 2025622192; 2025. [in Russian]. URL: https://vniimk.ru/science/bazy-dannykh-i-programmy-dlya-evm/ljrevtyns-2 [дата обращения: 22.06.2024].Гучетль С.З., Головатская А.В., Рамазанова С.А., Волошко А.А. Генетическое разнообразие линий подсолнечника российской селекции, выявленное с помощью анализа микросателлитных локусов. Аграрная наука Евро-Северо-Востока. 2023;24(2):173-186. DOI: 10.30766/2072-9081.2023.24.2.173-186Guchetl S.Z., Golovatskaya А.V., Ramazanova S.А., Voloshko А.А. Genetic diversity of the Russian sunflower breeding lines revealed by microsatellite loci analysis. Agricultural Science Euro-North-East. 2023;24(2):173-186. [in Russian]. DOI: 10.30766/2072-9081.2023.24.2.173-186Guichoux E., Lagache L., Wagner S., Chaumeil P., Léger P., Lepais O. et al. Current trends in microsatellite genotyping. Molecular Ecology Resources. 2011;11(4):591-611. DOI: 10.1111/j.1755-0998.2011.03014.xGuichoux E., Lagache L., Wagner S., Chaumeil P., Léger P., Lepais O. et al. Current trends in microsatellite genotyping. Molecular Ecology Resources. 2011;11(4):591-611. DOI: 10.1111/j.1755-0998.2011.03014.xHoffman J.I., Amos W. Microsatellite genotyping errors: detection approaches, common sources and consequences for paternal exclusion. Molecular Ecology. 2005;14(2):599-612. DOI: 10.1111/j.1365-294X.2004.02419.xHoffman J.I., Amos W. Microsatellite genotyping errors: detection approaches, common sources and consequences for paternal exclusion. Molecular Ecology. 2005;14(2):599-612. DOI: 10.1111/j.1365-294X.2004.02419.xLiu C., Zhao N., Jiang Z.C., Zhang H., Zhai H., He S.Z. et al. Analysis of genetic diversity and population structure in sweetpotato using SSR markers. Journal of Integrative Agriculture. 2023;22(11):3408-3415. DOI: 10.1016/j.jia.2023.02.004Liu C., Zhao N., Jiang Z.C., Zhang H., Zhai H., He S.Z. et al. Analysis of genetic diversity and population structure in sweetpotato using SSR markers. Journal of Integrative Agriculture. 2023;22(11):3408-3415. DOI: 10.1016/j.jia.2023.02.004Mason A.S. SSR genotyping. In: J. Batley (ed.). Methods in Molecular Biology. Vol. 1245. Plant Genotyping. New York, NY: Humana Press; 2015. p.77-89. DOI: 10.1007/978-1-4939-1966-6_6Mason A.S. SSR genotyping. In: J. Batley (ed.). Methods in Molecular Biology. Vol. 1245. Plant Genotyping. New York, NY: Humana Press; 2015. p.77-89. DOI: 10.1007/978-1-4939-1966-6_6NIH. National Library of Medicine. National Center for Biotechnology Information: [website]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov [accessed Mar. 25, 2025].NIH. National Library of Medicine. National Center for Biotechnology Information: [website]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov [accessed Mar. 25, 2025].NIH. National Library of Medicine. National Center for Biotechnology Information. Primer-BLAST: A tool for finding specific primers: [website]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast [accessed Mar. 25, 2025].NIH. National Library of Medicine. National Center for Biotechnology Information. Primer-BLAST: A tool for finding specific primers: [website]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast [accessed Mar. 25, 2025].Paniego N., Echaide M., Muñoz M., Fernández L., Torales S., Faccio P. et al. Microsatellite isolation and characterization in sunflower (Helianthus annuus L.). Genome. 2002;45(1):34-43. DOI: 10.1139/g01-120Paniego N., Echaide M., Muñoz M., Fernández L., Torales S., Faccio P. et al. Microsatellite isolation and characterization in sunflower (Helianthus annuus L.). Genome. 2002;45(1):34-43. DOI: 10.1139/g01-120Ramazanova S.A., Badyanov E.V., Guchetl S.Z. Validation of microsatellite markers to identify Pl6, Pl8 and Plarg genes that control resistance to Plasmopara halstedii in sunflower. Caspian Journal of Environmental Sciences. 2021;19(5):915-920. DOI: 10.22124/CJES.2021.5266Ramazanova S.A., Badyanov E.V., Guchetl S.Z. Validation of microsatellite markers to identify Pl6, Pl8 and Plarg genes that control resistance to Plasmopara halstedii in sunflower. Caspian Journal of Environmental Sciences. 2021;19(5):915-920. DOI: 10.22124/CJES.2021.5266Ramya K.T., Vishnuvardhan Reddy A., Sujatha M. Agromorphological and molecular analysis discloses wide genetic variability in sunflower breeding lines from USDA, USA. Indian Journal of Genetics and Plant Breeding. 2019;79(2):444-452. DOI: 10.31742/IJGPB.79.2.8Ramya K.T., Vishnuvardhan Reddy A., Sujatha M. Agromorphological and molecular analysis discloses wide genetic variability in sunflower breeding lines from USDA, USA. Indian Journal of Genetics and Plant Breeding. 2019;79(2):444-452. DOI: 10.31742/IJGPB.79.2.8Шеллер М.А. Чиокырлан Е., Михайлов П.В., Кулаков С.С., Кулакова Н.Н., Ибе А.А. и др. Генетическое разнообразие сосны обыкновенной (P. sylvestris L.) в средней Сибири по результатам анализа изменчивости хлоропластных микросателлитных локусов. Биосфера. Междисциплинарный научный и прикладной журнал. 2023;15(4):343-348. DOI: 10.24855/biosfera.v15i4.868Sheller M.A., Ciocirlan E., Mikhailov P.V., Kulakov S.S., Kulakova N.N., Ibe A.A. et al. Genetic diversity of scots pine (P. sylvestris L.) in middle Siberia assessed by analysis of variability of chloroplast microsatellite loci. Biosfera. Interdisciplinary Journal of Basic and Applied Sciences. 2023;15(4):343-348. [in Russian]. DOI: 10.24855/biosfera.v15i4.868Шилов И.А., Велишаева Н.С., Анискина Ю.В., Колобова О.С., Шалаева Т.В., Борисенко О.М. и др. Генетическая идентификация линий и гибридов подсолнечника Helianthus annuus L. на основе мультиплексного микросателлитного анализа. Достижения науки и техники АПК. 2023;37(1):10-15. DOI: 10.53859/02352451_2023_37_1_10Shilov I.A., Velishaeva N.S., Aniskina Yu.V., Kolobova O.S., Shalaeva T.V., Borisenko O.M. et al. Genetic identification of Helianthus annuus L. sunflower lines and hybrids based on multiplex microsatellite analysis. Achievements of Science and Technology of AIC. 2023;37(1):10-15. [in Russian]. DOI: 10.53859/02352451_2023_37_1_10Tang S., Yu J.K., Slabaugh B., Shintani D.K., Knapp S.J. Simple sequence repeat map of the sunflower genome. Theoretical and Applied Genetics. 2002;105(8):1124-1136. DOI: 10.1007/s00122-002-0989-yTang S., Yu J.K., Slabaugh B., Shintani D.K., Knapp S.J. Simple sequence repeat map of the sunflower genome. Theoretical and Applied Genetics. 2002;105(8):1124-1136. DOI: 10.1007/s00122-002-0989-yThe R Project for Statistical Computing: [website]. Available from: https://www.r-project.org [accessed Mar. 25, 2025].The R Project for Statistical Computing: [website]. Available from: https://www.r-project.org [accessed Mar. 25, 2025].Topu M., Sesiz U., Bektaş H., Toklu F., Özkan H. Next-generation-sequencing-based simple sequence repeat (SSR) marker development and linkage mapping in lentil (Lens culinaris L.). Life (Basel). 2023;13(7):1579. DOI: 10.3390/life13071579Topu M., Sesiz U., Bektaş H., Toklu F., Özkan H. Next-generation-sequencing-based simple sequence repeat (SSR) marker development and linkage mapping in lentil (Lens culinaris L.). Life (Basel). 2023;13(7):1579. DOI: 10.3390/life13071579Verbiest M., Maksimov M., Jin Y., Anisimova M., Gymrek M., Bilgin S.T. Mutation and selection processes regulating short tandem repeats give rise to genetic and phenotypic diversity across species. Journal of Evolutionary Biology. 2023;36(2):321-336. DOI: 10.1111/jeb.14106Verbiest M., Maksimov M., Jin Y., Anisimova M., Gymrek M., Bilgin S.T. Mutation and selection processes regulating short tandem repeats give rise to genetic and phenotypic diversity across species. Journal of Evolutionary Biology. 2023;36(2):321-336. DOI: 10.1111/jeb.14106Wang X., Wang L. GMATA: an integrated software package for genome-scale SSR mining, marker development and viewing. Frontiers in Plant Science. 2016;7:1350. DOI: 10.3389/fpls.2016.01350Wang X., Wang L. GMATA: an integrated software package for genome-scale SSR mining, marker development and viewing. Frontiers in Plant Science. 2016;7:1350. DOI: 10.3389/fpls.2016.01350Wickham H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. New York, NY: Springer-Verlag; 2016. DOI: 10.1007/978-0-387-98141-3Wickham H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. New York, NY: Springer-Verlag; 2016. DOI: 10.1007/978-0-387-98141-3Yadav S., Carvalho J., Trujillo I., Prado M. Microsatellite markers in olives (Olea europaea L.): Utility in the cataloging of germplasm, food authenticity and traceability studies. Foods. 2021;10(8):1907. DOI: 10.3390/foods10081907Yadav S., Carvalho J., Trujillo I., Prado M. Microsatellite markers in olives (Olea europaea L.): Utility in the cataloging of germplasm, food authenticity and traceability studies. Foods. 2021;10(8):1907. DOI: 10.3390/foods10081907

The authors declare that there are no conflicts of interest present.