vir-nwТруды по прикладной ботанике, генетике и селекцииProceedings on applied botany, genetics and breeding2227-88342619-0982N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources10.30901/2227-8834-2021-3-101-110vir-nw-1034Research ArticleГЕНЕТИКА КУЛЬТУРНЫХ РАСТЕНИЙ И ИХ ДИКИХ РОДИЧЕЙGENETICS OF CULTIVATED PLANTS AND THEIR WILD RELATIVESЛинии генетической коллекции подсолнечника ВИР, устойчивые к ложной мучнистой росеLines resistant to downy mildew in the sunflower genetic collection at VIRhttps://orcid.org/0000-0002-8110-9168ГавриловаВ. А.GavrilovaV. A.

190000 Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42, 44

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia

v.gavrilova@vir.nw.ruСтупниковаТ. Г.StupnikovaT. G.

190000 Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42, 44

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia

МакароваЛ. Г.MakarovaL. G.

190000 Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42, 44

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia

https://orcid.org/0000-0002-5531-2728АлпатьеваН. В.AlpatievaN. V.

190000 Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42, 44

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia

https://orcid.org/0000-0002-8384-5134КарабицинаЮ. И.KarabitsinaYu. I.

190000 Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42, 44

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia

https://orcid.org/0000-0002-9804-1286КузнецоваЕ. Б.KuznetsovaE. B.

190000 Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42, 44

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia

https://orcid.org/0000-0003-0474-8860АнисимоваИ. Н.AnisimovaI. A.

190000 Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42, 44

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia

Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И.ВавиловаРоссияN.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic ResourcesRussian Federation2021071020211823101110Copyright © Гаврилова В.А., Ступникова Т.Г., Макарова Л.Г., Алпатьева Н.В., Карабицина Ю.И., Кузнецова Е.Б., Анисимова И.Н., 20212021Гаврилова В.А., Ступникова Т.Г., Макарова Л.Г., Алпатьева Н.В., Карабицина Ю.И., Кузнецова Е.Б., Анисимова И.Н.Gavrilova V.A., Stupnikova T.G., Makarova L.G., Alpatieva N.V., Karabitsina Y.I., Kuznetsova E.B., Anisimova I.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://elpub.vir.nw.ru/jour/article/view/1034Актуальность

Актуальность. Ложная мучнистая роса (ЛМР), вызываемая грибом Plasmopara halstedii (Farl) Berl. & De Toni, – одно из самых вредоносных заболеваний подсолнечника (Helianthus annuus L.). Ежегодно из-за поражения патогеном теряется от 30 до 70% урожая семян. Создание линий, устойчивых к новым расам возбудителя, необходимо для селекции промышленных гибридов подсолнечника.

Материал и методы

Материал и методы. В 2016–2018 гг. оценивали по устойчивости к ЛМР в полевых условиях Кубанской опытной станции – филиала ВИР 323 линии и 10 сортов коллекции подсолнечника. Контролем служила линия ВИР 845, поражаемая ЛМР во все годы наблюдений. Для идентификации генов устойчивости провели молекулярный анализ с использованием диагностических маркеров генов Plarg, Pl6 и Pl8, детерминирующих устойчивость к большинству известных рас P. halstedii.

Результаты

Результаты. Сорта – родоначальники линий ВИР оказались неустойчивы в той или иной степени. Выявлены 39 линий, устойчивых в 2016 и 2018 г., из них 36 были поражены в 2017 г. Предполагается, что в 2017 г. имела распространение другая раса P. halstedii по сравнению с расами, преобладавшими в 2016 и 2018 г., в связи с чем гены, определявшие устойчивость в 2016 и 2018 г., оказались неэффективными. Линии ТА 716-18, ВИР 768, ВИР 800, полученные из межвидовых гибридов, демонстрировали отсутствие поражения в течение трех лет испытания. У большинства линий, показавших устойчивость в 2016 и 2018 г., детектированы маркеры генов Plarg, Pl6 и Pl8. У линий ВИР 768 и ВИР 800 маркеры отсутствовали, у ТА 716-18 обнаружены маркеры генов Plarg и Pl8.

Заключение

Заключение. В результате многолетнего исследования создана признаковая коллекция подсолнечника, включающая генотипированные линии с различными генами устойчивости к ЛМР. Линии ТА 716-18, ВИР 768 и ВИР 800 высокоустойчивы к патогену и, по-видимому, несут новые гены/аллели устойчивости, интрогрессированные от дикого вида.

Background

Background. Downy mildew (DM) caused by the fungus Plasmopara halstedii (Farl) Berl. & De Toni) is one of the most harmful diseases of sunflower (Helianthus annuus L.). Due to the pathogen’s attacks, annual seed harvest losses range between 30% and 70%. Lines resistant to new races of the pathogen should be obtained for the development of commercial sunflower hybrids.

Materials and methods

Materials and methods. Downy mildew resistance of 323 lines and 10 cultivars from the sunflower collection was assessed in the field at the Kuban Experiment Station of VIR in 2017–2018. Line VIR 845, susceptible during all years of observations, was used as a control. Resistance genes were identified by means of the molecular analysis using diagnostic markers of the Plarg, Pl6 and Pl8 genes that confer resistance to many known P. halstedii races.

Results

Results. The founder varieties of VIR’s lines were susceptible to a varying extent. Thirty-nine lines were resistant in 2016 and 2018; among those, 36 lines were susceptible in 2017. Presumably, a more virulent P. halstedii race became widespread in 2017, compared to the races that prevailed in 2016 and 2018, so the genes that determined resistance in 2016 and 2018 turned out to be ineffective. Lines ТА 716-18, VIR 768, and VIR 800, having originated from interspecific hybrids, exhibited absence of pathogenic damage during 3 years of the trials. Molecular markers of the Plarg, Pl6 and Pl8 genes were detected in most lines that demonstrated resistance in 2016 and 2018. There were no markers in lines VIR 768 and VIR 800, whereas in ТА 716-18 the markers of Plarg and Pl8 were present.

Conclusion

Conclusion. As a result of the long-term studies, a trait-specific genetic collection was established for sunflower. It comprises genotyped lines with various effective DM resistance genes. Lines ТА 716-18, VIR 768 and VIR 800 appeared highly resistant to the pathogen and probably possess new resistance genes/alleles introgressed from wild species.

Helianthus annuusгенетические ресурсыPlasmopara halstediiрасыгены устойчивостимолекулярные маркерыHelianthus annuusgenetic resourcesPlasmopara halstediiracesresistance genesmolecular markersРабота выполнена в рамках государственного задания согласно тематическому плану ВИР по проекту № 0662-2019-0001 «Коллекция масличных и прядильных культур ВИР: Изучение и расширение генетического разнообразия».The research was performed within the framework of the State Task according to the theme plan of VIR, Project No. 0662- 2019-0001 “The collection of oil and fiber crops at VIR: maintenance, study, and genetic diversity expansion”.ReferencesAl-Chaarani G.R., Roustaee A.M., Gentzbittel L., Mokrani L., Barrault G., Dechamp-Guillaume G. et al. A QTL analysis of sunflower partial resistance to downy mildew (Plasmopara halstedii) and black stem (Phoma macdonaldii) by the use of recombinant inbred lines (RILs). Theoretical and Applied Genetics. 2002;104(2-3):490-496. DOI: 10.1007/s001220100742Al-Chaarani G.R., Roustaee A.M., Gentzbittel L., Mokrani L., Barrault G., Dechamp-Guillaume G. et al. A QTL analysis of sunflower partial resistance to downy mildew (Plasmopara halstedii) and black stem (Phoma macdonaldii) by the use of recombinant inbred lines (RILs). Theoretical and Applied Genetics. 2002;104(2-3):490-496. DOI: 10.1007/s001220100742Анащенко A.В. Методические указания по изучению мировой коллекции масличных культур. Подсолнечник / под ред. Г. Г. Давидяна. Ленинград: ВИР; 1978.Anashchenko A.V. Guidelines for the study of the world collection of oil crops. Sunflower (Metodicheskiye ukazaniya po izucheniyu mirovoy kollektsii maslichnykh kultur. Podsolnechnik). G.G. Davidyan (ed.). Leningrad: VIR; 1978. [in Russian]Анисимова И.Н., Алпатьева Н.В., Абдуллаев Р.А., Карабицина Ю.И., Кузнецова Е.Б. Скрининг генетических ресурсов растений с использованием ДНК-маркеров: основные принципы, выделение ДНК, постановка ПЦР, электрофорез в агарозном геле: (методические указания) / под ред. Е.Е. Радченко. Санкт-Петербург: ВИР; 2018. DOI:10.30901/978-5-905954-81-8Anisimova I.N., Alpatieva N.V., Abdullaev R.A., Karabitsina Yu.I., Kuznetsova E.B. Screening of plant genetic resources with the use of DNA markers: basic principles, DNA isolation, PCR setup, agarose gel electrophoresis: (guidelines). E.E. Radchenko (ed.). St. Petersburg: VIR; 2018. [in Russian] DOI:10.30901/978-5-905954-81-8Антонова Т.С., Ивебор М.В., Рожкова В.Т., Арасланова Н.М., Гаврилова В.А. Результаты оценки образцов подсолнечника коллекции ВИР на устойчивость к расам возбудителя ложной мучнистой росы, распространенным в Краснодарском крае. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 2011;167:90-95.Antonova T.S., Ivebor M.V., Rozhkova V.T., Araslanova N.P., Gavrilova V.A. Results of evaluating sunflower accessions from the VIR collection for resistance to the races of false mildew common for Krasnodar Territory. Bulletin of Applied Botany, of Genetics, and Plant Breeding. 2011;167:90-95. [in Russian]Bouzidi M.F., Badaoui S., Cambon F., Vear F., de Labrouhe D.T., Nicolas P. et al. Molecular analysis of a major locus for resistance to downy mildew in sunflower with specific PCR-based markers. Theoretical and Applied Genetics. 2002;104(4):592-600. DOI: 10.1007/s00122-001-0790-3Bouzidi M.F., Badaoui S., Cambon F., Vear F., de Labrouhe D.T., Nicolas P. et al. Molecular analysis of a major locus for resistance to downy mildew in sunflower with specific PCR-based markers. Theoretical and Applied Genetics. 2002;104(4):592-600. DOI: 10.1007/s00122-001-0790-3Gascuel Q., Martinez Y., Boniface M.C., Vear F., Pichon M., Godiard L. The sunflower downy mildew pathogen Plasmopara halstedii. Molecular Plant Pathology. 2015;16(2):109-122. DOI: 10.1111/mpp.12164Gascuel Q., Martinez Y., Boniface M.C., Vear F., Pichon M., Godiard L. The sunflower downy mildew pathogen Plasmopara halstedii. Molecular Plant Pathology. 2015;16(2):109-122. DOI: 10.1111/mpp.12164Гаврилова В.А., Анисимова И.Н. Генетика культурных растений. Подсолнечник. Санкт-Петербург: ВИР; 2003.Gavrilova V.A., Anisimova I.N. Genetics of cultivated plants. Sunflower. St. Petersburg: VIR, 2003. [in Russian]Gavrilova V.A., Rozhkova V.T., Anisimova I.N. Sunflower genetic collection at the Vavilov Institute of Plant Industry. Helia. 2014;37(60):1-16. DOI: 10.1515/helia-2014-0001Gavrilova V.A., Rozhkova V.T., Anisimova I.N. Sunflower genetic collection at the Vavilov Institute of Plant Industry. Helia. 2014;37(60):1-16. DOI: 10.1515/helia-2014-0001Гаврилова В.А., Анисимова Н.И., Алпатьева Н.В., Рожкова В.Т., Ступникова Т.Г., Карабицина Ю.И., Кузнецова Е.Б. Каталог мировой коллекции ВИР. Выпуск 853. Генетическая коллекция подсолнечника. Санкт-Петербург: ВИР; 2017.Gavrilova V.A., Anisimova I. N., Alpatyeva N.V., Rozhkova V.T, Stupnikova T.G. Karbitsina Yu.I., Kuznetsova E.B. Catalogue of the VIR global collection. Issue 853. Sunflower genetic collection. St. Petersburg: VIR; 2017. [in Russian]Dimitrijevic A., Horn R. Sunflower hybrid breeding: from markers to genomic selection. Frontiers in Plant Science. 2018;8:2238. DOI: 10.3389/fpls.2017.02238Dimitrijevic A., Horn R. Sunflower hybrid breeding: from markers to genomic selection. Frontiers in Plant Science. 2018;8:2238. DOI: 10.3389/fpls.2017.02238Imerovski I., Dimitrijević A., Miladinović D., Jocić S., Dedić B., Cvejić S. et al. Identification and validation of breederfriendly DNA markers for Plarg gene in sunflower. Molecular Breeding. 2014;34(3):779-788. DOI: 10.1007/s11032-014-0074-7Imerovski I., Dimitrijević A., Miladinović D., Jocić S., Dedić B., Cvejić S. et al. Identification and validation of breederfriendly DNA markers for Plarg gene in sunflower. Molecular Breeding. 2014;34(3):779-788. DOI: 10.1007/s11032-014-0074-7Коршунова А.Ф. Мильдью подсолнечника. В кн.: Обзор распространения главнейших массовых вредителей и болезней сельскохозяйственных культур в 1959 г. и прогноз их появления в 1960 г. Москва: ВАСХНИЛ; 1960. C.144-146.Korshunova A.F. Downy mildew of sunflower (Mildyu podsolnechnika). In: Overview of the spread of major mass crop pests and diseases in 1959 and the forecast of their appearance in 1960 (Obzor rasprostraneniya glavneyshikh massovykh vrediteley i bolezney selskokhozyaystvennykh kultur v 1959 g. i prognoz ikh poyavleniya v 1960 g.). Moscow: VASKhNIL; 1960. p.144-146. [in Russian]Li J.T., Yang J., Chen D.C., Zhang X.I., Tang Z.S. An optimized mini-preparation method to obtain high-quality geno mic DNA from mature leaves of sunflower. Genetics and Molecular Research. 2007;6(4):1064-1071.Li J.T., Yang J., Chen D.C., Zhang X.I., Tang Z.S. An optimized mini-preparation method to obtain high-quality geno mic DNA from mature leaves of sunflower. Genetics and Molecular Research. 2007;6(4):1064-1071.Ma G., Song Q., Underwood W.R., Zhang Z., Jason D. Fiedler J.D. et al. Molecular dissection of resistance gene cluster and candidate gene identification of Pl17 and Pl19 in sunflower by whole-genome resequencing. Scientific Reports. 2019;9:14974. DOI: 10.1038/s41598-019-50394-81Ma G., Song Q., Underwood W.R., Zhang Z., Jason D. Fiedler J.D. et al. Molecular dissection of resistance gene cluster and candidate gene identification of Pl17 and Pl19 in sunflower by whole-genome resequencing. Scientific Reports. 2019;9:14974. DOI: 10.1038/s41598-019-50394-81Mouzeyar S., Tourvieille de Labrouhe D., Vear F. Effect of host-race combination on resistance of sunflower, Helianthus annuus L., to downy mildew Plasmopara halstedii. Journal of Phytopathology. 1994;141(3):249-258. DOI: 10.1111/j.1439-0434.1994.tb01468.xMouzeyar S., Tourvieille de Labrouhe D., Vear F. Effect of host-race combination on resistance of sunflower, Helianthus annuus L., to downy mildew Plasmopara halstedii. Journal of Phytopathology. 1994;141(3):249-258. DOI: 10.1111/j.1439-0434.1994.tb01468.xНовотельнова Н.С. Ложная мучнистая роса подсолнечника. Москва; Ленинград: Наука; 1966Novotelnova N.S. Downy mildew of sunflower (Lozhnaya muchnistaya rosa podsolnechnika). Moscow; Leningrad: Nauka; 1966. [in Russian]Pecrix Y., Buendia L., Penouilh-Suzette C., Maréchaux M., Legrand L., Bouchez O. et al. Sunflower resistance to multiple downy mildew pathotypes revealed by recognition of conserved effectors of the oomycete Plasmopara halstedii. The Plant Journal. 2019;97(4):730-748. DOI: 10.1111/tpj.14157Pecrix Y., Buendia L., Penouilh-Suzette C., Maréchaux M., Legrand L., Bouchez O. et al. Sunflower resistance to multiple downy mildew pathotypes revealed by recognition of conserved effectors of the oomycete Plasmopara halstedii. The Plant Journal. 2019;97(4):730-748. DOI: 10.1111/tpj.14157Pecrix Y., Penouilh-Suzette C., Muños S., Vear F., Godiard L. Ten broad spectrum resistances to downy mildew physically mapped on the sunflower genome. Frontiers in Plant Science. 2018;9:1780. DOI: 10.3389/fpls.2018.01780Pecrix Y., Penouilh-Suzette C., Muños S., Vear F., Godiard L. Ten broad spectrum resistances to downy mildew physically mapped on the sunflower genome. Frontiers in Plant Science. 2018;9:1780. DOI: 10.3389/fpls.2018.01780Qi L.L., Foley M.E., Cai X.W., Gulya T.J. Genetics and mapping of a novel downy mildew resistance gene, Pl(18), introgressed from wild Helianthus argophyllus into cultivated sunflower (Helianthus annuus L.). Theoretical and Applied Genetics. 2016;129(4):741-752. DOI: 10.1007/s00122-015-2662-2Qi L.L., Foley M.E., Cai X.W., Gulya T.J. Genetics and mapping of a novel downy mildew resistance gene, Pl(18), introgressed from wild Helianthus argophyllus into cultivated sunflower (Helianthus annuus L.). Theoretical and Applied Genetics. 2016;129(4):741-752. DOI: 10.1007/s00122-015-2662-2Qi L.L., Long Y.M., Jan C.C., Ma G.J., Gulya T.J. Pl(17) is a novel gene independent of known downy mildew resistance genes in the cultivated sunflower (Helianthus annuus L.). Theoretical and Applied Genetics. 2015;128(4):757-767. DOI: 10.1007/s00122-015-2470-8Qi L.L., Long Y.M., Jan C.C., Ma G.J., Gulya T.J. Pl(17) is a novel gene independent of known downy mildew resistance genes in the cultivated sunflower (Helianthus annuus L.). Theoretical and Applied Genetics. 2015;128(4):757-767. DOI: 10.1007/s00122-015-2470-8Radwan O., Bouzidi M.F., Nicolas P. Mouzeyar S. Development of PCR markers for the Pl5/Pl8 locus for resistance to Plasmopara halstedii in sunflower, Helianthus annuus L. from complete CC-NBS-LRR sequences. Theoretical and Applied Genetics. 2004;109:176-185. DOI: 10.1007/s00122-004-1613-0Radwan O., Bouzidi M.F., Nicolas P. Mouzeyar S. Development of PCR markers for the Pl5/Pl8 locus for resistance to Plasmopara halstedii in sunflower, Helianthus annuus L. from complete CC-NBS-LRR sequences. Theoretical and Applied Genetics. 2004;109:176-185. DOI: 10.1007/s00122-004-1613-0Radwan O., Bouzidi M.F., Mouzeyar S. Molecular characterization of two types of resistance in sunflower to Plasmopara halstedii, the causal agent of downy mildew. Phytopathology. 2011;101(8):970-979. DOI: 10.1094/PHYTO-06-10-0163Radwan O., Bouzidi M.F., Mouzeyar S. Molecular characterization of two types of resistance in sunflower to Plasmopara halstedii, the causal agent of downy mildew. Phytopathology. 2011;101(8):970-979. DOI: 10.1094/PHYTO-06-10-0163Radwan O., Bouzidi M.F., Vear F., Phil ippon J., Tourvieille de Labrouhe D., Nicolas P. et al. Identification of non-TIRNBSLRR markers linked to the Pl5/Pl8 locus for resistance to downy mildew in sunflower. Theoretical and Applied Genetics. 2003;106(8):1438-1446. DOI: 10.1007/s00122-003-1196-1Radwan O., Bouzidi M.F., Vear F., Phil ippon J., Tourvieille de Labrouhe D., Nicolas P. et al. Identification of non-TIRNBS- LRR markers linked to the Pl5/Pl8 locus for resistance to downy mildew in sunflower. Theoretical and Applied Genetics. 2003;106(8):1438-1446. DOI: 10.1007/s00122-003-1196-1Рамазанова С.А., Антонова Т.С. К вопросу о маркировании локусов Pl, контролирующих устойчивость подсолнечника к возбудителю ложной мучнистой росы. Масличные культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. 2019;1(177):17-23). DOI: 10.25230/2412-608X-2019-1-177-17-23Ramazanova S.A., Antonova T.S. To a question about marking of Pl loci controlling sunflower resistance to downy mildew pathogen. Oil Crops. Scientific and Technical Bulletin of VNIIMK. 2019;1(177):17-23. [in Russian] DOI: 10.25230/2412-608X-2019-1-177-17-23Молекулярные маркеры генов Pl6, Pl13 и Plarg для использования в селекции подсолнечника на устойчивость к ложной мучнистой росе. Масличные культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. 2020;3(183):20-27. DOI: 10.25230/2412-608X-2020-3-183-20-26Ramazanova S.A., Badyanov E.V., Guchetl S.Z. Molecular markers of genes Pl6, Pl13 and Plarg for sunflower breeding on resistance to downy mildew. Oil Crops. Scientific and Technical Bulletin of VNIIMK. 2020;3(183):20-27. [in Russian] DOI: 10.25230/2412-608X-2020-3-183-20-26Spring O. Spreading and global pathogenic diversity of sunflower downy mildew – Review. Plant Protection Science. 2019;55(3):149-158. DOI: 10.17221/32/2019-PPSSpring O. Spreading and global pathogenic diversity of sunflower downy mildew – Review. Plant Protection Science. 2019;55(3):149-158. DOI: 10.17221/32/2019-PPSUsatov A.V., Klimenko A.I., Azarin K.V., Gorbachenko O.F., Markin N.V., Tikhobaeva V.E. et al. DNA-markers of sunflower resistance to the downy mildew (Plasmopara halstedii). American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 2014;10(2):125-129. DOI: 10.3844/ajbbsp.2014.125.129Usatov A.V., Klimenko A.I., Azarin K.V., Gorbachenko O.F., Markin N.V., Tikhobaeva V.E. et al. DNA-markers of sunflower resistance to the downy mildew (Plasmopara halstedii). American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 2014;10(2):125-129. DOI: 10.3844/ajbbsp.2014.125.129Vear V. Classic genetics and breeding. In: J. Hu, G. Seiler, Ch. Kole (eds). Genetics, Genomics and Breeding of Sunflower. Enfield, NH: Science Publishers; 2010. p. 50-77.Vear V. Classic genetics and breeding. In: J. Hu, G. Seiler, Ch. Kole (eds). Genetics, Genomics and Breeding of Sunflower. Enfield, NH: Science Publishers; 2010. p. 50-77.Wieckhorst S., Bachlava E., Dussle C.M., Tang S., Gao W., Saski C. et al. Fine mapping of the sunflower resistance locus Plarg introduced from the wild species Helianthus argophyllus. Theoretical and Applied Genetics. 2010;121(8):1633-1644. DOI: 10.1007/s00122-010-1416-4Wieckhorst S., Bachlava E., Dussle C.M., Tang S., Gao W., Saski C. et al. Fine mapping of the sunflower resistance locus Plarg introduced from the wild species Helianthus argophyllus. Theoretical and Applied Genetics. 2010;121(8):1633-1644. DOI: 10.1007/s00122-010-1416-4

The authors declare that there are no conflicts of interest present.